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摘要结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer）公布的2020年数据显示，全球新增超过193万例结直肠癌病例占全球新确诊癌症人数的9.7%。中国是结直肠癌的高发地区，在2020年,中国新增超过55万例结直肠癌病例占中国新确诊癌症人数的12.2%。<br>　　结直肠癌的发生发展与肠道炎症存在一定关系。细胞焦亡是一种依赖于Gasdermin蛋白的程序性、炎症性细胞死亡方式。Gasdermin蛋白家族成员均含有Gasdermin-N端和Gasdermin-C端，Gasdermin蛋白被剪切为N端和C端，其中N端发挥打孔功能，C端对N端起到抑制作用。N端在细胞膜上形成孔洞时，细胞外液体大量进入细胞内，细胞表面“吹”出许多大泡，最终细胞胀破死亡，释放出大量的细胞内物质和炎症因子。目前已明确诱导焦亡机制的Gasdermin蛋白有GSDMB（Gasdermin-B）、GSDMD（Gasdermin-D）和GSDME（Gasdermin-E）。<br>　　晚期结直肠癌患者的治疗以放化疗为主。已有文献报道，化疗药物可以活化Caspase-3，当肿瘤细胞内有GSDME蛋白表达时，Caspase-3会剪切GSDME，得到GSDME-N端和C端，GSDME-N端发挥打孔作用，介导细胞焦亡，细胞死亡方式从凋亡转为焦亡。<br>　　约1%-2%的结直肠癌病例与炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）有关，10%-15%的IBD患者死于结直肠癌。IBD的辅助诊断指标钙卫蛋白可以反应肠道炎症的严重程度。钙卫蛋白是S100A8（S100calcium binding protein A8）和S100A9（S100calcium binding protein A9）形成的异二聚体。其中S100A8属于S100钙结合蛋白家族，S100A8蛋白可以与钙离子结合，在细胞内可以调节内环境的钙离子稳态。肠道炎症越严重，S100A8蛋白分泌越多。在结直肠癌中S100A8表达越高，组织分化程度越低，越容易出现淋巴结转移，患者预后越差。<br>　　GTEx数据库分析结果显示，健康人结肠组织中的GSDME与S100A8在mRNA表达水平没有明显相关性；TCGA数据库分析结果显示，结直肠癌患者肿瘤组织中的GSDME和S100A8在mRNA表达水平呈显著正相关性；进一步分别分析直肠癌（rectum adenocarcinoma，READ）和结肠癌（colon adenocarcinoma，COAD）肿瘤组织中GSDME与S100A8表达在mRNA水平的相关性，结果显示均呈显著正相关。为进一步确认GSDME和S100A8表达之间的关系，对300例结直肠癌组织样本进行染色、观察。对肿瘤细胞GSDME和S100A8染色阳性情况的相关性进行分析，结果显示S100A8和GSDME在结直肠癌中的表达显著相关。以上结果提示，在结直肠癌中S100A8和GSDME的表达密切相关。<br>　　Nigericin，即尼日利亚菌素，是炎症小体激活剂，也是诱导细胞焦亡的经典药物之一。利用nigericin诱导细胞焦亡，检测GSDME蛋白剪切情况、乳酸脱氢酶释放水平并观察细胞形态，构建以nigericin为诱导药物的细胞焦亡模型。<br>　　分别以nigericin诱导过表达和敲降GSDME的细胞发生焦亡，结果显示过表达GSDME可以促进GSDME-N端的剪切，上调S100A8的表达，促进细胞焦亡；敲降GSDME可以下调S100A8表达，抑制细胞焦亡。分别诱导过表达和敲降S100A8的细胞发生焦亡，结果显示过表达S100A8可以促进Caspase-3的活化，GSDME-N端的剪切，促进细胞焦亡；敲降S100A8可以抑制Caspase-3的活化，GSDME-N端的剪切，抑制细胞焦亡。综合以上结果，GSDME上调S100A8的表达，促进细胞焦亡；S100A8可以促进Caspase-3的活化，GSDME-N的剪切，促进细胞焦亡。<br>　　已有文献报道，钙离子参与细胞焦亡的内源性修复机制，细胞外钙离子浓度降低，钙离子内流不足会抑制细胞膜的修复，促进细胞焦亡。S100A8蛋白具有很强的钙离子亲和力，细胞外钙离子浓度对焦亡的影响与GSDME、S100A8是否有关呢？<br>　　首先，检测了细胞外低钙离子水平对细胞焦亡的影响。用Cacl2溶液调节细胞外钙离子浓度，与正常钙离子浓度组相比，细胞外低钙促进细胞焦亡，细胞外高钙对细胞焦亡没有明显影响。之后，选择乙二醇四乙酸（EGTA）作为细胞外钙离子螯合剂，结果显示细胞外钙离子浓度降低可以促进Caspase-3的活化，GSDME-N端的剪切，上调S100A8表达，促进细胞焦亡。<br>　　细胞外钙离子是否通过GSDME和S100A8调节细胞焦亡呢？诱导敲降GSDME的细胞发生焦亡的同时，加入EGTA降低细胞外钙离子浓度，细胞死亡率仍上升；诱导敲降S100A8的细胞发生焦亡的同时，加入EGTA降低细胞外钙离子浓度，细胞死亡率仍上升。以上结果显示，细胞外钙离子浓度降低可以促进细胞焦亡，但是在这个过程中Caspase-3活化增加，GSDME-N端剪切增加和S100A8表达上调的意义是什么还有待研究。<br>　　考虑到S100A8可以调节内环境的钙离子稳态，S100A8促细胞焦亡的作用是否与细胞内钙离子有关？诱导过表达S100A8的细胞发生焦亡后，细胞内钙离子浓度增加，且增加幅度明显大于对照组细胞；敲降S100A8的细胞发生焦亡后细胞内钙离子浓度没有明显变化。用Caspase-3抑制剂处理过表达S100A8的细胞后，再用nigericin诱导细胞焦亡，结果显示过表达S100A8不再促进细胞焦亡。<br>　　以上结果提示，S100A8可能是通过促进细胞内钙离子浓度增加，促进Caspase-3的活化，从而促进细胞焦亡，但是还需进一步螯合细胞内钙离子来明确S100A8是否通过钙离子来调控焦亡。<br>　　综合实验结果，得出以下结论<br>　　1.GSDME可以促进S100A8表达，促进细胞焦亡。<br>　　2.S100A8可以促进Caspase-3活化，GSDME剪切，促进细胞焦亡。<br>　　3.细胞外钙离子浓度降低可以促进细胞焦亡，但S100A8不影响该过程。<br>　　4.S100A8可以促进细胞焦亡过程中细胞内钙离子浓度的增加。