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摘要迟缓爱德华氏菌是水产养殖中危害最严重的病原菌之一，对人们的生产生活造成巨大的经济损失。如何防治迟缓爱德华氏菌一直是困扰养殖者和研究者们的难题。迟缓爱德华氏菌的致病机制尚未研究清楚，目前已知迟缓爱德华氏菌利用T3SS、T6SS、鞭毛系统、铁吸收因子、群体感应、双组分系统和胞外素等致病因子在宿主细胞中侵染和存活。T3SS是迟缓爱德华氏菌中最重要的两个分泌系统之一，能够合成、组装、分泌毒性蛋白和效应蛋白，在感染宿主过程中起到至关重要的作用。Orf13作为迟缓爱德华氏菌T3SS中的分子伴侣，在病菌内能保护needle蛋白在分泌之前不被降解，并且可以作为分泌蛋白分泌到宿主体内。CUGBP2是一类RNA结合蛋白，在动物的心脏及肌肉功能、早期胚胎发育、神经递质传递及细胞凋亡过程中至关重要。已有研究表明Orf13与小鼠RNA结合蛋白CUGBP2存在相互作用，但是它们具体的结合方式、互作机制及在迟缓爱德华氏菌致病过程中行使的功能尚未阐明。<br>　　本课题以迟缓爱德华氏菌T3SS分子伴侣Orf13和小鼠RNA结合蛋白CUGBP2为研究材料，从蛋白结构和功能等方面对CUGBP2和Orf13的互作机制进行了研究和阐述。主要研究结果如下：<br>　　1.以迟缓爱德华氏菌全基因组PPD130/91和CUGBP2cDNA为模板，扩增Orf13全长和CUGBP2全长、截短片段并构建载体，通过共表达纯化获得CUGBP2-1/Orf13蛋白复合物，并验证了CUGBP2/Orf13的相互作用。将其进行结晶初筛但是并没有晶体生长。<br>　　2.通过生物信息学分析、不完全酶解等方法，设计19个CUGBP2表达片段，最终获得可结晶的蛋白复合物CUGBP2-2/Orf13、CUGBP2-3/Orf13、CUGBP2-4/Orf13、CUGBP2-5/Orf13和CUGBP2-6/Orf13共5种。将这些蛋白复合物进行结晶初筛。<br>　　3.CUGBP2-2/Orf13和CUGBP2-5/Orf13两种蛋白复合物初筛条件长出了晶体，对这些晶体条件进行优化（温度、蛋白浓度、缓冲液等）。最终条件为0.2mol/LKCl，20%w/vPolyethyleneglycol3350，pH7.0生长出的晶体可进行X-射线衍射，表达载体为pET-28b-6His-CUGBP2-1和pGEX-6p-1-Orf13。<br>　　4.晶体分辨率为2.1?，解析了CUGBP2-5/Orf13的复合物结构。与CUGBP2/RNA的结构做对比，结果表明Orf13与RNA之间并不存在空间重叠。<br>　　5.通过酵母双杂交分析CUGBP2/Orf13之间的关键互作位点，表明CUGBP2(Phe446,Ala479,Met484)和Orf13(Gln53)为结合的关键位点，突变这些位点后CUGBP2和Orf13蛋白相互作用完全消失；CUGBP2(Val475)和Orf13(Leu7,Asp25,Gln29)对结合的影响较强，突变这4个位点，蛋白相互作用减弱一半以上；另外CUGBP2(Met442,Pro445,Ser476,Gln478,Gln488)和Orf13(Glu29,Val63)对蛋白相互作用影响不大。<br>　　6.利用凝胶迁移实验确定Orf13对CUGBP2和RNA之间相互作用的影响。结果表明Orf13的加入会加强CUGBP2和RNA的结合。<br>　　本研究通过大量的蛋白表达和结晶尝试，解析了CUGBP2/Orf13的复合物结构，分析发现了两者间的关键作用位点，证明了Orf13影响CUGBP2和RNA的结合。为深入研究Orf13的功能，同时为抑菌药物和疫苗的研发提供新思路，体内试验需要进一步地探索。对迟缓爱德华氏菌的研究有助于新细菌感染防治方法的发展，以及疾病爆发的预防。