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摘要目的：在建立阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）肾精亏虚证、痰浊阻窍证、瘀血阻络证病证结合动物模型的基础上，通过应用蛋白免疫印迹法、免疫组织化学、免疫荧光等方法，探讨AD不同证候类型在tau蛋白异常磷酸化位点的差异及相关生物学机制，部分阐释AD同病异证在tau蛋白异常磷酸化方面的微观病理改变，为同病异证理论提供现代生物学依据。<br>　　方法：<br>　　1.构建AD三典型证候病证结合模型、AD疾病模型及假手术组模型。<br>　　（1）AD肾精亏虚证病证结合模型的构建：该组大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖（D-gal）持续48天，构建亚急性衰老大鼠模型，模拟肾精亏虚证；并于行为学检测前一周在大鼠大脑双侧海马CA1区注射凝聚态Aβ25-35毒性片段，复合构建AD肾精亏虚证病证结合模型（简称肾精亏虚组）。<br>　　（2）AD痰浊阻窍证病证结合模型的构建：该组大鼠颈背部皮下注射D-gal持续48天，构建衰老期肾精亏虚的大鼠模型，同时给予高脂饮食喂养，于行为学检测前一周在大鼠大脑双侧海马CA1区注射凝聚态Aβ25-35毒性片段，复合构建本虚标实的AD痰浊阻窍证病证结合模型（简称痰浊阻窍组）。<br>　　（3）AD瘀血阻络证病证结合模型的构建：该组大鼠颈背部皮下注射D-gal持续48天，构建衰老期肾精亏虚的大鼠模型，并予0℃冰水浴28天，于行为学检测前一周在大鼠大脑双侧海马CA1区注射凝聚态Aβ25-35毒性片段，复合构建本虚标实的AD瘀血阻络证病证结合模型（简称瘀血阻络组）。<br>　　（4）AD疾病模型的构建：该组大鼠于行为学检测前一周在大鼠大脑双侧海马CA1区注射凝聚态Aβ25-35毒性片段，构建AD疾病模型，与上述三典型证候组做阳性对照（简称AD组）。<br>　　（5）假手术组模型的构建：该组大鼠颈背部皮下注射生理盐水持续48天，行为学检测前一周在大鼠大脑双侧海马CA1区注射灭菌生理盐水，与上述四组做对照。<br>　　实验中，除痰浊阻窍组大鼠以高脂饲料喂养外，其余组别大鼠均以普通饲料喂养。<br>　　2.疾病及证候模型的验证。检测各组大鼠抗氧化能力相关指标的改变，以验证肾精亏虚证候模型；检测血脂水平的变化，以验证痰浊阻窍证候模型；检测血液流变学的变化，以验证瘀血阻络证候模型；Morris水迷宫及海马组织尼氏染色法用以从行为学和组织形态学验证AD疾病模型。<br>　　3.AD同病异证tau蛋白磷酸化位点的检测。采用蛋白免疫印迹法（Westernblot，WB）、免疫组织化学、免疫荧光等技术，检测AD上述三种典型证候tau蛋白磷酸化位点的差异，检测位点包括Thr181、Thr231、Ser409、Thr212、Ser396、Ser214、Thr205、Ser199、Ser404。<br>　　4.与tau蛋白磷酸化相关蛋白激酶的检测。采用蛋白免疫印迹法，检测AD各证候类型组中与tau蛋白磷酸化相关蛋白激酶周期蛋白依赖激酶5（cyclindependencekinase5,CDK5）和糖原合成酶激酶3β（glycogensynthesiskinase3β，GSK3β）的表达情况。<br>　　结果：<br>　　1.证候模型的验证：<br>　　（1）肾精亏虚证：各证候组大鼠皮层、海马抗氧化能力降低，血清NOS及脂质过氧化产物含量增多，表明给予D-gal后，大鼠的抗氧化能力降低，衰老期的肾精亏虚证候模型构建成功。<br>　　（2）痰浊阻窍证：痰浊阻窍组大鼠血胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白含量增高，表明痰浊阻窍证候模型构建成功。<br>　　（3）瘀血阻络证：瘀血阻络组大鼠全血高切粘度、血浆粘度增高，红细胞压积增高、纤维蛋白原含量增多，表明该组大鼠的血液处于“粘、浓、凝、聚”状态，瘀血阻络证候模型构建成功。<br>　　2.疾病模型的验证：<br>　　Morris水迷宫检测结果显示AD组以及不同证候组大鼠学习记忆能力下降，海马区神经元出现不同程度的凋亡，表明给予Aβ25-35毒性片段脑定位注射后，大鼠的学习记忆能力受损，AD疾病模型构建成功。<br>　　3.WB检测结果：<br>　　（1）肾精亏虚证：该组海马tau蛋白在Thr181、Thr231、Ser409、Thr212、Ser396位点的磷酸化水平均有增加。<br>　　（2）痰浊阻窍证：该组海马tau蛋白以Thr181、Thr231、Ser409的过度磷酸化显著增加为主。<br>　　（3）瘀血阻络证：该组海马tau蛋白以Thr212、Ser396的过度磷酸化显著增加为主。<br>　　（4）CDK5和GSK3β两种蛋白激酶在AD组及三典型证候模型组的表达均有增加，其中GSK3β在三证候组中的增加更显著。<br>　　结论：<br>　　1.以D-gal长期颈背部皮下注射可制备亚急性衰老模型，模拟中医肾精亏虚证；以高脂饲料喂养大鼠可构建痰浊阻窍证候模型；以0℃冰水浴可构建瘀血阻络证候模型；大鼠双侧海马CA1区定位注射Aβ25-35可制备AD疾病模型。这几种方法结合，复合制备AD肾精亏虚证、痰浊阻窍证、瘀血阻络证病证结合模型。这一方法基本符合中医学病因病机证候理论内涵。抗氧化能力水平、血脂水平、血液流变学改变、Morris水迷宫检测、海马组织尼氏染色可以作为验证模型是否成功的生物学指标。<br>　　2.AD肾精亏虚证、痰浊阻窍证、瘀血阻络证tau蛋白磷酸化位点存在差异，其中肾精亏虚证在Thr181、Thr231、Ser409、Thr212、Ser396位点的磷酸化均有增加；Thr181、Thr231、Ser409位点的过度磷酸化与痰浊阻窍证相关；Thr212、Ser396位点的过度磷酸化与瘀血阻络证相关。<br>　　3.GSK3β在AD三典型证候组的表达明显增加，该蛋白激酶可能在衰老机体内参与了Aβ25-35促进tau蛋白相关位点的磷酸化过程。<br>　　4.本研究对AD不同证候在tau蛋白异常磷酸化的微观病理变化进行了比较研究，结果表明痰浊阻窍证、瘀血阻络证的特异性tau蛋白磷酸化位点在肾精亏虚证候模型中均有增加，支持了中医学对AD病机以“肾精亏虚为本，痰浊、瘀血阻滞脑络为标”的理论认识和同病异证理论。