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摘要目的<br>　　本研究拟从AD发病的主要原因Aβ聚集作为切入点，从行为学、神经系统损伤、氧化应激、炎症损伤、免疫调节和细胞凋亡等方面入手，综合运用Morris水迷宫实验、避暗实验、酶联免疫吸附、免疫组织化学、流式细胞术、蛋白免疫印迹、RT-PCR等实验方法，通过整体动物和细胞水平观察醒脑益智组分中药的神经保护作用，阐明该方防治AD的作用机制和作用靶点，为AD治疗提供创新组分中药，并提供新思路。<br>　　方法<br>　　1.AD动物模型的筛选：对D-gal腹腔注射、Aβ1-40海马内注射以及复合造模三种方法进行考察，以Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力，确定适宜大鼠模型。<br>　　2.药物对AD模型大鼠的学习记忆障碍研究：Wistar大鼠随机分6组：假手术组、AD模型组、石杉碱甲组、醒脑益智组分中药高剂量组、中剂量组和低剂量组，建立复合AD模型后连续给药30d，进行行为学测试，记录Morris水迷宫实验中各组动物的逃避潜伏期、穿台次数、寻找平台的总路程及穿越平台象限路程；采用回避性条件反射-避暗实验观察各组大鼠的逃避潜伏期和记忆错误次数，观察药物对大鼠学习记忆功能障碍的影响。<br>　　3.药物对AD模型大鼠的脑保护作用研究：取行为学实验结束后的各组大鼠，麻醉取脑及外周血。采用HE染色观察海马及皮层神经元形态学改变；免疫组化法检测脑组织NeuN、Bcl-2及Caspase-3表达情况；ELISA法检测脑组织及血清中总SOD、MDA、BDNF、AchE等含量；Westernblot测定大鼠脑组织NeuN、BDNF、IL-1β、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达的情况。<br>　　4.药物对AD模型大鼠的免疫调节作用研究：取行为学实验结束后的各组大鼠，取脾脏、胸腺等器官，计算脏器指数，并制备脾脏及外周血淋巴细胞，流式细胞仪检测脾脏及外周血中T细胞亚群CD3+CD4+，CD3+CD8+百分比及CD3+CD4+/CD3+CD8+比例，ELISA法检测血清炎症因子TNF-α、IL-1β的含量。<br>　　5.药物对Aβ1-40致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用研究：体外细胞实验中，采用MTT法和LDH释放检测对药物及Aβ的不同浓度及作用时间进行考察，确定适宜的药物作用范围、时间及Aβ的最佳造模浓度、时间；观察药物对Aβ损伤细胞细胞活力及LDH释放的影响，ELISA法检测细胞内总SOD、MDA、BDNF、AchE、TNF-α和IL-1β含量，荧光探针标记检测细胞内总ROS活性，WesternBlot法测定细胞中NeuN、IL-1β等蛋白表达情况。<br>　　6.药物对Aβ1-40致细胞凋亡作用研究：采用Hochest33258荧光染色观察细胞形态变化，AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡，Western-blot检测Bax、Bcl-2等蛋白的表达，RT-PCR测定Bax、Bcl-2mRNA基因表达情况。<br>　　结果<br>　　1.模型评价：Morris水迷宫行为学结果显示，各模型组大鼠逃避潜伏期较造模前延长，穿台次数也较造模前减少，以复合造模组较为显著（P＜0.05）。最终以复合造模方法建立动物模型。<br>　　2.对AD模型大鼠行为学影响：与模型组比较，定向航行实验中，各给药组大鼠逃避潜伏期降低，以阳性药物和高剂量组作用较明显（P＜0.05）。空间探索实验中，各给药组大鼠穿台次数较模型组有所增加，穿越第四象限的路程百分比也均有提高，以阳性药物和高、中剂量组作用较显著（P＜0.05）。<br>　　3.对AD模型大鼠的脑保护作用：与模型组比较，各给药组能明显改善SH-SY5Y细胞形态；药物高、中剂量组能使AD大鼠脑组织及血清中SOD活性提高，MDA含量明显降低（P＜0.05），AchE活性降低（P＜0.05），BDNF、NeuN含量升高（P＜0.05），Bcl-2表达量升高，Bax、Caspase-3、Caspase-9表达量减少。<br>　　4.对AD模型大鼠的免疫调节作用：与模型组比较，各给药组脾脏及外周血CD3+CD4+细胞数量百分比增加，CD3+CD8+细胞数量百分比有降低趋势，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值均较模型组升高，TNF-α、IL-1β含量均有所降低，以药物高剂量作用效果较好（P＜0.05）。<br>　　5.体外细胞实验中，选取Aβ1-4015μmol?L-1作为实验浓度，作用时间24h，建立SH-SY5Y细胞损伤模型。选取70、35、17.5μg?mL-1药物浓度，作用时间为24h进行后续实验。①细胞增殖保护作用：MTT与LDH释放实验结果显示，与模型组比较，药物不同剂量均能显著改善Aβ1-40诱导的细胞损伤，并能使BDNF、NeuN含量增加，AchE含量降低，以药物高剂量组作用显著（P＜0.05），各单药组对正常细胞增殖具有一定促进作用；②氧化应激作用：药物高、中剂量组SOD活性显著提高、MDA含量降低，并抑制Aβ1-40刺激细胞产生的ROS，同时降低TNF-α和IL-1β含量（P＜0.05）。<br>　　6.药物对Aβ1-40诱导细胞凋亡作用研究：与模型组相比，给药组细胞核荧光染色数量减少，早期细胞凋亡率显著降低，以高剂量组较明显（P＜0.05）；凋亡蛋白Bax等表达降低，Bcl-2表达升高，各剂量组BaxmRNA相对表达明显降低，Bcl-2mRNA的表达有所增加，以高、中剂量组较为显著（P＜0.05）。<br>　　结论<br>　　1.行为学实验表明醒脑益智组分中药对AD模型大鼠学习记忆障碍有一定改善作用。<br>　　2.神经系统损伤方面，可通过调节脑部BDNF和NeuN含量，降低AchE活性，提高胆碱受体密度来保护中枢胆碱能系统。<br>　　3.氧化应激方面，通过增加SOD活性，降低总ROS活性，减少MDA生成，对抗机体氧化。<br>　　4.炎症与免疫方面，与调节T细胞亚群中CD3+CD4+/CD3+CD8+比值，并下调促炎性因子TNF-α和IL-1β的表达有关。<br>　　5.细胞凋亡方面，调节凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2、Caspase-9及Caspase-3表达，降低神经元细胞凋亡，最终表现出脑保护作用。