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摘要硫化氢（H2S）是一种气体信号分子，介导了抗氧化、抗衰老等多种生理生化过程，且在阿尔兹海默症、亨廷顿舞蹈症等神经退行性疾病中均有积极作用。老年性黄斑变性（age-relatedmaculardegeneration，AMD）是由于视网膜中央获得最佳视力的黄斑发生退行性变性引起视力不可逆性衰退的一种神经退行性疾病。AMD多发生在老年人群中，是造成老年人群体失明的主要原因。预计到2040年，AMD的患病率将翻两番，但至今尚无AMD的有效治疗手段。因此，H2S是否对AMD具有潜在的治疗意义，这值得深入地探究。视网膜色素上皮（retinalretinalpigmentepithelium，RPE）细胞是位于感光细胞和Bruch’s膜之间的一种单层细胞，对维持视网膜的完整性及功能性具有重要作用。RPE细胞的功能紊乱或死亡与AMD等多种神经视网膜疾病有关，是一种常用于研究AMD的细胞模型。本课题以人视网膜色素上皮细胞ARPE-19为研究对象，以H2O2为氧化损伤诱导剂构建氧化损伤模型，将硫氢化钠（NaHS）作为H2S的供体，初步探究NaHS对H2O2诱导的氧化损伤是否具有保护效果，并进一步探究其作用机制，为H2S在AMD的发生与治疗方面的应用提供理论基础。<br>　　首先，以细胞存活率为依据，本文初步确定：NaHS对氧化应激环境中的ARPE-19细胞具有显著的保护效果。其次，H2O2诱导ARPE-19细胞内活性氧、脂质过氧化以及铁含量水平增加，线粒体膜电位去极化；细胞凋亡和坏死性凋亡抑制剂Z-VAD-FKM、Nec-1等对H2O2诱导ARPE-19细胞死亡均无显著抑制效果，细胞凋亡的蛋白标志物cl-caspaes3也无明显变化。这些结果表明：在H2O2诱导的ARPE-19细胞死亡中，细胞凋亡和坏死性凋亡不占主导地位，其死亡方式可能与铁死亡有关。<br>　　接着，进一步探究H2S作用的内在机制，发现H2S通过提高细胞自噬水平发挥保护作用。主要分为以下三个部分进行探究：（1）NaHS单处理促进自噬标志物LC3Ⅱ的表达，自噬小体合成增强。（2）利用两种方法检测H2S对细胞自噬流的影响。比较添加BaflomycinA1前后LC3Ⅱ表达量的变化，结果显示NaHS诱导的自噬流是通畅的；利用病毒pLVX-eGFP-mCherry-LC3B结合共聚焦显微镜监测细胞自噬流，发现NaHS处理后细胞内红色点状物增多，自噬溶酶体数量明显增多，细胞自噬通量显著提高。（3）自噬在H2S的保护效果中发挥重要作用。通过westernblotting检测发现，H2O2处理组的ATG7、Beclin1等自噬相关蛋白均下调，而外加NaHS后均有一定程度的恢复，这表明了自噬与H2S保护效果的关联性。用自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）与NaHS共处理后，NaHS的保护效果一定程度上减弱。另外，利用RNA干扰（RNAi）技术构建稳定细胞株shATG7和shBECN1。与NC细胞相比，细胞shATG7和shBECN1对H2O2损伤更敏感性，且NaHS的保护效果也相应减弱。由此可见，NaHS诱导的细胞自噬为保护性自噬，细胞自噬与NaHS在ARPE-19细胞中的保护效果密切相关。<br>　　NaHS是如何诱导细胞自噬？通过蛋白免疫印迹法检测了AMPK/mTORC1通路相关蛋白的磷酸化水平，结果显示NaHS增强了AMPK和ULK1磷酸化水平，而mTORC1及其下游蛋白p70S6K活性受到抑制。因此，NaHS可能磷酸化AMPKThr172和ULK1Ser555，激活自噬起始阶段；并抑制了mTORC1通路,自噬抑制作用减弱，最终增强保护性自噬。<br>　　研究表明，激活p62/NRF2途径可以抑制铁死亡的发生。在本研究中，NaHS提高蛋白p62的表达量，敲减p62后NaHS的保护作用明显减弱，说明p62在NaHS保护作用中扮演着一定角色。另外，转录组及荧光定量PCR的结果表明，包括p62在内的NRF2靶基因的mRNA水平均显著提高，表明NRF2被激活。因此，这里作出合理推测，NaHS可能通过促进p62表达，增强NRF2核转位，细胞抗氧化能力提高，抑制H2O2诱导的ARPE-19细胞死亡。<br>　　综上所述，本课题的研究发现，（1）NaHS保护ARPE-19细胞免受H2O2诱导的氧化损伤，且H2O2诱导的ARPE-19细胞死亡可能与铁死亡有关；（2）NaHS可能通过AMPK/mTORC1途径提高细胞自噬，抑制细胞死亡，发挥保护作用；也可能通过p62/NRF2途径提高细胞抗氧化能力参与到其中。NaHS对ARPE-19细胞的保护作用，及其内在机制的探究，为H2S在AMD防治中的应用提供了潜在条件。同时，铁死亡与H2S、自噬的关系，也值得深入探究。