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摘要Pin1是一种肽基脯氨酰顺反异构酶（peptidyl-prolylcis/transisomerase，PPIase），可特异性将底物中pSer/pThr-Pro模体的顺式构象转为反式构象，从而调节一系列生理生化过程。Pin1作为多种致癌信号通路中的调节因子，至少激活43个癌基因和失活超过20个肿瘤抑制因子。因此，Pin1是一个独特且有吸引力的药物靶点，研究Pin1与抑制剂的相互作用以及发掘新型抑制剂对肿瘤的治疗具有积极作用。<br>　　膳食黄酮是一类来源于植物的多酚类化合物，由苯环A（A环）、苯环B（B环）和吡喃环C（C环）构成，具有多种药用特性。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）和表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）是绿茶主要的活性成分，属于膳食黄酮中的黄烷醇类。EGCG含有一个功能性没食子酰基团，具有较强的化学预防效应。研究没食子酰基团对Pin1结构的影响以及膳食黄酮结构上的差异对Pin1的构效关系，可为Pin1相关疾病的药物设计提供理论指导。Pin1的过表达与癌症，尤其是肝癌的不良临床预后密切相关。基于虚拟筛选结合生物学实验，靶向Pin1抑制肝癌发展的新型小分子抑制剂的发现，对肝癌临床治疗具有一定的指导价值。本论文以异构酶Pin1为靶蛋白，研究其与膳食黄酮相互作用及其靶向抑制剂的虚拟筛选。具体内容如下：<br>　　第一部分：Pin1及其突变体的构建、原核表达与纯化。基于定点突变技术，将Pin1的关键残基His59、Lys63、Arg68、Arg69、Cys113、Met130、Ser154和His157对应的密码子突变为丙氨酸密码子“GCG”，构建pET-19b-Pin1突变体质粒。然后，将构建成功的质粒导入表达菌株中，低温诱导表达，收集裂解液上清，进行亲和纯化。最后，使用组氨酸标签抗体和Pin1抗体进行Westernblot，对收集到的目的蛋白进行验证。这部分工作主要是为后续实验打下基础。<br>　　第二部分：光谱学和计算模拟研究没食子酰基团对Pin1结构的影响。荧光发射光谱展示，EGCG对Pin1的荧光淬灭是一个动态淬灭和静态淬灭同时进行的过程，而EGC对Pin1的荧光淬灭只是一个静态淬灭过程。EGCG和EGC对Pin1的结合位点分别为2和1。热力学参数、结合模型、计算模拟和预测的结合自由能表明，氢键、范德华力和疏水作用是EGCG和EGC结合到Pin1过程中的主要结合力。同步荧光光谱、三维荧光光谱、圆二色谱和傅里叶变换红外光谱表明，EGCG和EGC都能影响Pin1的构象。色氨酸荧光滴定、分子对接和分子动力学模拟揭示，EGCG结合PPIase结构和WW结构域，而EGC仅结合PPIase结构域。这项研究阐明了没食子酰基团对Pin1结构的影响，为开发没食子酰基团的药物去治疗Pin1相关的疾病提供一定的启发。<br>　　第三部分：荧光光谱、异构酶活和计算模拟探究膳食黄酮对Pin1的构效关系。荧光实验表明，膳食黄酮对Pin1的淬灭过程均为静态淬灭。热力学参数和计算模拟表明，膳食黄酮主要通过氢键、范德华键和疏水作用与Pin1结合。分子对接和突变体荧光滴定揭示，膳食黄酮结构上的差异会影响与关键残基的结合。此外，膳食黄酮对Pin1的亲和力和抑制作用取决于其结构差异。羟基甲基化、B环异构化、C环糖基化和C2=C3双键氢化降低对Pin1的亲和力和抑制作用，而A环、B环和C环的羟基化增强对Pin1的亲和力和抑制作用。这些结果有助于了解黄酮类化合物对Pin1的构效关系，为设计治疗Pin1相关疾病的药物提供有价值的参考。<br>　　第四部分：虚拟筛选鉴定Pin1小分子抑制剂对肝癌潜在的抗肿瘤效应。通过计算筛选结合生物学实验，发现一种新型抑制剂S12通过结合关键残基Lys63、Arg68和Arg69来抑制Pin1活性，IC50值为1.06μmol/L。此外，S12呈剂量和时间依赖性抑制Huh7和SK-Hep-1细胞增殖、迁移和侵袭，并触发凋亡和细胞周期阻遏。同时，S12诱导Pin1降解，阻断Huh7和SK-Hep-1细胞中多种Pin1依赖的致癌信号通路。我们的研究表明，S12是一种新型靶向Pin1的小分子抑制剂，具有潜在的抗肝癌效应。<br>　　本研究首先纯化Pin1及其关键残基突变体蛋白。然后，采用多种光谱学技术结合计算模拟探究没食子酰基团对Pin1结构的影响。同时，也探讨九种膳食黄酮与Pin1的构效关系，为基于黄酮类药物抑制Pin1的活性提供理论基础。此外，通过虚拟筛选结合生物学实验，发现新型抑制剂S12靶向Pin1对肝癌具有潜在的抗肿瘤效应。总之，探究Pin1与膳食黄酮相互作用及其靶向抑制剂的虚拟筛选，为设计治疗与Pin1相关的疾病的新型药物提供理论研究基础。