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摘要目的：<br>　　为了缓解因为全球人口数量增长而导致的全球环境保护压力和资源利用压力的增加，以及避免意外妊娠对妇女和儿童带来的伤害，人们仍在寻找更加方便安全的避孕措施。男性避孕药的开发长期以来受到了科研界以及医药界的关注。激素类药物的开发较早，其进行的研究和临床试验也比较丰富，然而激素类药物会在整个精子的形成过程中发挥不良作用，使用的药量也对男性健康有潜在的风险。为了开发替代避孕的方法，人们对许多非激素避孕靶点和药物进行了广泛的研究。在非激素药物的开发中，通过调控精子特异性表达蛋白来控制男性的生育能力是大家关注的方向之一。BET（Bromodomainandextraterminaldomain）蛋白家族包括BRD2（Bromodomain-containingprotein2），BRD3，BRD4和BRDT，是通过识别组蛋白H4（Histone4）的赖氨酸乙酰化，来进行基因表达调控的转录控制因子。而BRDT作为睾丸特异表达的转录调控因子，在精子变形的过程中发挥着重要作用。因此，我们希望可以开发一种靶向BRDT的男性避孕药物。BET家族蛋白都有两个序列保守的溴域结构域BD1（Bromodomain1）和BD2，还有一个介导蛋白相互作用的末端结构域ET（extra-terminal）。BRD4和BRDT还包含一个负责促进招募转录调节因子的C端基序CTM（C-terminalmotif）。BRDT基因主要在粗线期精母细胞，双线期精母细胞和圆形精子细胞表达，精子成熟后表达主要定位在细胞核。选择性缺失BRDT的第一个溴域结构域BD1的纯合小鼠丧失生育能力，这些研究表明利用BRDT作为避孕药物的靶点拥有广阔的前景。我们合作者开发了新一代的BET家族抑制剂NHWD870，本论文探讨了NHWD870对精子发生与精子成熟抑制作用机制和成为男性避孕先导化合物的潜力。<br>　　材料和方法：<br>　　本研究通过计算机药物结构预测软件拟合了BET家族抑制剂NHWD870与Brdt的结合结构图。我们通过体外细胞实验检测了NHWD870对不同睾丸细胞（GC1、GC2、TM3和TM4）的增殖，凋亡和氧化应激损伤的影响。通过动物体内实验检测了NHWD870对雄鼠精子发生的影响，通过HE染色和动物交配实验评估NHWD870作为避孕药物先导化合物的避孕效果和生育能力的恢复情况。通过放射免疫分析检测了NHWD870对雄鼠激素水平的影响。通过转录组学和蛋白组学研究分析了NHWD870对睾丸内精子发生的影响。为了检测NHWD870对精子pH的影响，我们开发新型的双色荧光的金纳米探针。<br>　　结果：<br>　　细胞增殖实验结果显示NHWD870在10nM浓度下对GC1、TM3和TM4具有显著性的抑制增殖的作用，在100nM浓度下对GC2有明显的抑制作用。在100nM浓度下GC1和TM3的早期凋亡细胞数量增加了一倍，GC2和TM4细胞的凋亡数量未见差异。NHWD870处理细胞后TM3的氧化应激损伤明显增加，GC1、GC2和TM4的氧化应激水平变化没有差异。睾丸组织形态学表明NHWD870组与对照组小鼠睾丸相比，1mg/kg、2mg/kg和3mg/kg小鼠的形态未见异常；4mg/kg组的小鼠睾丸体积明显减小，睾丸称重后结果显示4mg/kg组的小鼠睾丸重量降低了50%。我们从小鼠的附睾尾部获得成熟的精子进行精子数目的统计，计数结果显示，CTL，1mg/kg、2mg/kg和3mg/kg组的小鼠精子数目没有差异，4mg/kg组的小鼠精子数目降低了70%。我们使用计算机辅助分析精子系统CASA（Computer-aidedspermanalysis）结果显示，C57小鼠服用NHWD870以后1mg/kg，2mg/kg，3mg/kg组别的小鼠精子运动能力显著降低，4mg/kg组的小鼠精子在视野下观察不到运动的精子。取材的睾丸石蜡切片染色显示，CTL、1mg/kg、2mg/kg和3mg/kg组的睾丸曲精小管内的精母细胞和精子细胞数量无明显差异、4mg/kg组的睾丸曲精小管内的精母细胞和精子细胞已经观察不到，仍有精原细胞的存在。附睾组织切片染色显示CTL、1mg/kg、2mg/kg组的附睾内精子数量无明显差异，3mg/kg组的附睾内精子数量降低，而4mg/kg组的附睾内几乎不可见精子。FSH（Follicle-stimulatinghormone）的水平在各组之间并无差异，LH（Luteotropichormone）水平随着NHWD870用量的增加出现了升高后降低的现象。CTL组和1mg/kg的睾酮水平没有差异，2mg/kg和3mg/kg睾酮水平下降了50%，4mg/kg的睾酮水平最低。C57小鼠NHWD870处理三周后停药，同时加入雌鼠做交配实验。在停药后的6周内统计了各组小鼠的总生育数量，在此期间1mg/kg、2mg/kg和3mg/kg的后代数量略有下降，4mg/kg组没有后代出生，说明4mg/kg剂量的NHWD870具有良好的避孕作用。停药8周后4mg/kg组有健康的后代出生，小鼠的怀孕周期为3周，因此推算出4mg/kg的小鼠最快能够在停药后6周恢复生育能力。并且NHWD870处理的各组之间每胎产仔数量并没有差异。我们将停药8周后的4mg/kgNHWD870处理的小鼠取睾丸和精子进行观察相比于CTL组，服药组小鼠停药两个月后睾丸的体积和重量恢复到正常状态，精子数量也恢复了60%。精子的活力比率也接近正常小鼠的状态。<br>　　NHWD870处理之后的转录组数据显示一共鉴定到了7507个差异基因，其中表达上调的有3614个，表达下调的有3893个。通过蛋白组学检测，我们一共鉴定到5842个蛋白，其中5454个可定量。两组间差异蛋白数量1292个，NHWD870处理组蛋白表达量上调的有648个，蛋白表达量下调的有644个。我们将转录组学和蛋白组学的差异基因进行联合分析后，得到其中共有1214个一致表达的差异基因，表达上调的基因有608个，表达下调的基因有606个。我们选取了与精子发生和受精差异最显著的前十个基因是：Akap4、Spaca7、Cetn1、Arl2bp、Sun3、Tssk4、Spaca1、Spa17、Zpbp、Kcnq2。他们参与了精子发生、微管和纤毛的组装、精子膜上的离子通道，这些基因的缺失会严重影响精子发生与成熟。<br>　　精子的pH变化与精子运动和精子获能等关键生理过程密不可分，因此准确的测定精子胞内pH变化对于理解精子成熟至关重要。AuNPspH探针是利用纳米金为材料连接罗丹明和荧光素分子而形成。其中，纳米金材料具有脂溶性强、生殖毒性低的特点；罗丹明和荧光素则具有独特的发射谱带（rhodamineλex～550nm,λem～580nm；fluoresceinλex～450nm,λem～510nm），这使得其灵敏度高，变色范围狭窄。AuNP探针在5.2-8.2的pH之间具有良好的指示pH的效果。AuNP探针染色结果显示随着NHWD870处理时间的增加，精子内AuNPs探针的红色荧光也越来越强，说明NHWD870处理后精子的pH减小并影响了精子的活力。<br>　　结论：<br>　　(1)在体外细胞层面，NHWD870可以和Brdt特异性结合。NHWD870可以抑制GC1，GC2，TM3和TM4细胞的增殖活性。NHWD870可以诱导GC1和TM3细胞的凋亡升高。NHWD870可以导致TM3细胞的活性氧水平增加。<br>　　(2)在动物层面，.NHWD870可以使小鼠精子的运动能力降低，睾丸体积和重量减小，服用三周后使雄鼠丧失生育能力，恢复6周以后小鼠的生育能力可以达到正常水平，说明NHWD870对精子发生的阻滞是可以逆转的。并且停药生育力恢复后可以得到健康的后代。NHWD870不会影响雄鼠的FSH和LH，但是血清的睾酮水平下降。<br>　　(3)转录组学和蛋白组学联合分析显示，NHWD870处理后下调的基因主要富集在精子发生，纤毛生成，精子运动，糖酵解，碱基修复等通路，上调的基因富集在凋亡，溶酶体和水解酶等通路。<br>　　(4)我们的AuNPpH探针可以很好的检测精子内的pH状态，并且AuNPpH探针的检测结果显示NHWD870处理的精子内pH偏酸性，可能影响了精子的运动能力。<br>　　综上所述，BET家族的抑制剂NHWD870作为针对Brdt靶点的避孕药物的先导化合物，具有非常好的潜力。