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摘要目的：<br>　　维持正常生理功能的滋养层细胞对胚胎植入过程中的识别、定位及粘附，母胎界面的构建及后期胎盘的形成具有重要作用。而滋养层细胞的异常形态及功能障碍可能影响早期胚胎分化、发育障碍、甚至导致胚胎发育迟滞或停止生长，导致不良妊娠结局的发生。因此，深入研究滋养层细胞行为变化对早期妊娠丢失有重要意义，我们通过高通量mRNA测序、lncRNA测序技术，对停育胚胎的绒毛组织进行mRNA及lncRNA的筛选及挖掘，寻找异常变化目标分子，预测其变化对滋养层细胞生物学功能的潜在影响，并通过建立体外植入模型及细胞学研究加以证实，为临床上胚胎停育及不明原因性流产的病因及分子生物学机制做出一定解释。<br>　　材料和方法：<br>　　1、收集2019年2月-2019年10月在华西第二医院门诊手术室进行人工流产术或清宫术的患者的绒毛组织（伦理审批编号：2018018），采用高通量mRNA、lncRNA测序检测绒毛组织中mRNA及lncRNA的表达谱。通过生物信息学分析寻找差异mRNA及lncRNA，明确差异基因富集条目及功能预测，并通过加权共表达网络分析寻找和差异基因具有共表达关系的lncRNA，以筛选具有潜在生物学功能的目标lncRNA。通过实时荧光定量PCR验证高通量测序结果的正确性。<br>　　2、构建目标lncRNA过表达质粒，将其转染至绒毛膜癌Bewo细胞。通过实时荧光定量PCR验证细胞瞬时转染效率。并通过超低粘附培养板诱导转染后的绒毛膜癌Bewo细胞成为球体以反映Bewo细胞-细胞间粘附能力，将转染后的Bewo球接种于子宫内膜上皮Ishikawa细胞表面，建立体外植入模型。通过上述细胞实验筛选具有调控粘附功能的目标lncRNA，最终确定CLRN1-AS1作为后续研究分子。<br>　　3、利用实时荧光定量PCR和荧光原位杂交，明确CLRN1-AS1在各类滋养层细胞株中的表达水平及细胞亚定位。通过酶消化法从绒毛组织中分离原代滋养层细胞，将CLRN1-AS1过表达质粒转染至原代滋养层细胞，通过实时荧光定量PCR验证细胞瞬时转染效率。将其接种于超低粘附培养板诱导成球，以反映绒毛外滋养层细胞-细胞间粘附能力。将转染后的绒毛外滋养层细胞球接种于子宫内膜上皮Ishikawa细胞表面，建立体外植入模型，观察其粘附效率，以模拟生理条件下胚胎植入前粘附状态。最后，利用Matrigel基质胶实验、Transwell实验明确在原代滋养层细胞中上调CLRN1-AS1对其细胞-细胞外基质、迁移及侵袭能力的影响。<br>　　结果：<br>　　1、早期停育胚胎绒毛组织的mRNA及lncRNA表达谱及功能预测结果：胚胎停育组的绒毛组织相较于正常对照组，有406个mRNA显著上调，32个mRNA显著下调。28个lncRNA显著上调，13个lncRNA显著下调。选择所有差异mRNA进行基因注释分析，共富集到54个条目，这些条目涉及白细胞激活、细胞-细胞/细胞外基质粘附、病原体感染、蛋白受体活性、细胞外分泌及免疫反应等。其中有6个条目归属于细胞粘附功能，呈现出高度的富集性。通过加权共表达网络筛选出三个与细胞粘附中差异基因关联程度最高的lncRNA，分别是CLRN1-AS1、USP27X-AS1及AC104809.4。<br>　　2、目标lncRNA降低Bewo-Ishikawa体外植入模型的粘附功能：转染CLRN1-AS1、USP27X-AS1及AC104809.4过表达质粒后，Bewo-Ishikawa细胞体外植入模型实验显示，空载质粒组、CLRN1-AS1、USP27X-AS1及AC104809.4组绒毛膜癌细胞Bewo诱导成球后的直径分别是550.62±88.51μm、393.02±70.14μm、384.50±29.95μm及408.25±23.26μm。CLRN1-AS1、USP27X-AS1及AC104809.4组相较于空载质粒组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。空载质粒组、CLRN1-AS1、USP27X-AS1及AC104809.4组中粘附于Ishikawa细胞的Bewo球数目分别是86±2、35±1、50±4及53±3个。CLRN1-AS1组相较于空载质粒组，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。USP27X-AS1及AC104809.4组相较于空载质粒组差异具有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　3、CLRN1-AS1过表达质粒降低原代滋养层细胞-Ishikawa体外植入模型的粘附、迁移、侵袭能力：经酶消化法从绒毛组织中得到原代滋养层细胞，HLA-G免疫荧光实验显示HLA-G阳性信号定位于原代滋养层细胞质。利用原代滋养层细胞-Ishikawa细胞建立体外植入模型，实验结果显示空载质粒组、CLRN1-AS1组原代EVT细胞诱导成球后的直径分别是550.25±82.69μm和409.63±19.74μm。两组数据间差异具有统计学意义（P＜0.05）。空载质粒组、CLRN1-AS1组中粘附于Ishikawa细胞的EVT球数目分别是72±6和36±2个。两组数据间差异具有统计学意义（P＜0.01）。EVT—细胞外基质粘附实验结果显示，对照组的原代滋养层细胞能紧密粘附于Matrigel基质胶表面，细胞延展性强，呈现高度张力。CLRN1-AS1组的原代滋养层细胞小而圆，延展性较差，不能紧密贴附于Matrigel基质胶表面。Transwell细胞迁移实验结果显示，空载质粒组及CLRN1-AS1组小室下层细胞数目分别为70±5和17±4个，两组数据间差异具有统计学意义（P＜0.01）。Transwell细胞侵袭实验结果显示，空载质粒组及CLRN1-AS1组小室下层细胞数目分别为44±3和16±2个，两组数据间差异具有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　1、高通量mRNA、lncRNA测序结果提示，早期胚胎停育发生时，绒毛组织中发生的病理变化涉及白细胞异常激活、细胞-细胞/细胞外基质粘附改变、病原体感染、蛋白受体活性异常、细胞外分泌异常及免疫反应等，其中最为关键的是细胞粘附能力的改变。与其粘附能力变化有关的目标lncRNA，分别是CLRN1-AS1、USP27X-AS1及AC104809.4。<br>　　2、Bewo-Ishikawa体外植入模型实验结果显示，lncRNA CLRN1-AS1、USP27X-AS1及AC104809.4均降低Bewo细胞-细胞间粘附能力及Bewo细胞与子宫内膜上皮细胞的粘附能力，提示目标lncRNA可能降低合体滋养层细胞的粘附能力。<br>　　3、原代EVT-Ishikawa体外植入模型实验结果显示，lncRNACLRN1-AS1降低原代EVT细胞-细胞间粘附能力及原代EVT细胞与子宫内膜上皮细胞的粘附能力，提示目标lncRNA可能降低绒毛外滋养层细胞的粘附能力。细胞-细胞外基质实验结果提示lncRNACLRN1-AS1降低原代滋养层细胞的细胞-细胞外基质粘附能力。Transwell实验结果提示lncRNA CLRN1-AS1降低原代滋养层细胞的迁移、侵袭能力。