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摘要遗传性凝血因子缺陷症是一类由先天性凝血因子质或者量缺陷而引起的出血性疾病，由编码凝血因子或编码参与凝血因子合成过程蛋白的基因发生突变所致。其出血严重程度因凝血因子缺陷的不同以及在凝血因子级联反应活化中功能的不同而各异。目前，临床对于此类疾病的诊断主要依赖病史、出血特征及实验室检查。其中实验室检查包括初筛实验和确诊实验。初筛实验主要包括血小板计数（PLT），反应内源性凝血途径的活化部分凝血活酶时间（activatedpartialthromboplatintime，APTT），反应外源性凝血途径的凝血酶原时间（prothrombintime，PT），及血浆纠正实验，据此对疾病进行初步诊断和分类。在此基础上对特定凝血因子进行活性和抗原的检测达到确诊目的。受凝血因子半衰期影响，功能试验检查具有时限性，此外，还受到治疗的影响（如：血浆输注，凝血因子输注等），影响临床诊断。因此，开展不受时间限制和治疗影响的基因诊断方法是必要的。<br>　　目前国内尚缺乏对于凝血因子缺陷症基因突变谱的大样本研究与报道。本研究对血友病A（FVIII缺陷）、血友病B（FIX缺陷）、及血友病C（FXI缺陷）基因突变资料进行分析，描述中国人群上述三种疾病相应的基因突变图谱，所发现的新发突变补充了相关疾病基因库。<br>　　目的：<br>　　1、建立和完善遗传性凝血因子缺乏症的基因诊断方法。<br>　　2、通过回顾性分析血友病A、血友病B、血友病C的F8、F9及F11基因检测结果，描述中国人群该3种疾病的基因突变图谱。<br>　　3、运用生物学在线软件对本次研究中发现的新突变进行致病性预测及分析，对凝血因子基因突变库进行补充。<br>　　方法：<br>　　第一部分：设计并合成8种遗传性凝血因子缺乏症（FII、FV、FVII、FX、FXII、FXIII、F5F8D、VKDFD）凝血因子基因的聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR）扩增引物，其中基因F5、GGCX、LMAN1及F13A1采用RT-PCR结合Sanger测序进行转录组检测，基因F2、F7、F10、F12、VKORC1、MCFD2及F13B采用PCR结合Sanger测序进行基因组检测。用正常志愿者标本探索PCR反应条件。对患者样本进行PCR扩增及双向sanger测序，测序结果用MutationSurveyorv5.1.1软件与美国国立生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)公布的基因序列进行对比，寻找突变位点，对实验方法进行阳性验证。<br>　　第二部分：回顾性分析华西康圣达医学检验有限公司2015年1月至2020年11月检测血友病A、血友病B、及遗传性FXI缺陷症患者的基因测序结果。F8基因检测方法为长距离PCR和双管多重PCR检测内含子22及内含子1倒位，双向Sanger测序检测F8基因所有外显子及侧翼序列。F9及F11测序方法为双向sanger测序，测序范围为F9（血友病B）及F11基因的所有外显子及侧翼序列。用MutationSurveyorv5.1.1软件与NCBI公布的F8，F9及F11基因序列进行对比寻找突变位点。用计算机软件MutationTaster、polyphen-2和PROVEAN对新突变进行致病性预测。<br>　　结果：<br>　　第一部分：建立了8种遗传性凝血因子缺乏症（FII、FV、FVII、FX、FXII、FXIII、F5F8D、VKDFD）基因检测方法，共包含11个基因（F2、F5、F7、F10、F12、GGCX、VKORC1、LMAN1、MCFD2、F13A1及F13B）。所有基因设计的扩增引物特异性较好，运用该检测方法能成功的检测出遗传性凝血因子缺乏患者的基因突变。<br>　　第二部分：分析了华西康圣达医学检验有限公司数据库中血友病A、血友病B、及遗传性FXI缺陷症患者的基因检测结果。218名血友病A进行了包括内含子22倒位、内含子1倒位、及F8基因检测。通过Sanger测序共检测出123种突变，包括65种错义突变，20种无义突变，1种同义突变，18种缺失突变，14种内含子变异，3种插入突变及2种重复突变。14号外显子是发生突变的高频区，最频发的突变为c.3780C＞G(p.Asp1260Glu)，c.3637delA(p.Ile1213Phefs*5)，及c.3169G＞A(p.Glu1057Lys）。经文献检索及数据库查阅确认发现33种新突变。86例血友病B患者的基因测序共发现64种FIX基因突变，包括40种错义突变，6种无义突变，6种缺失突变，6种内含子变异，2种重复突变，2种同义突变，2种位于UTR区的点突变及1种插入突变。F9基因最易发生突变的位置为8号外显子。经文献检索及数据库查阅确认有11种新突变。56例遗传性FXI缺陷症患者的基因测序共发现40种FXI基因突变，包括24种错义突变，8种无义突变，4种缺失突变，1种插入突变，2种内含子突变及1种重复突变。FXI基因最易发生突变的位置为编码催化结构域的11-15号外显子，最多发的突变为c.841C＞T(p.Gln281Ter)、c.738G＞A(p.Trp246Term)、c.1253G＞T(p.Gly418Val)、及c.1325delT(p.Leu442Cysfs*8)。经文献检索及数据库查阅确认有15种为新突变。<br>　　结论：<br>　　1.建立了用PCR/RT-PCR结合Sanger测序的遗传性凝血因子缺乏的基因诊断方法。涵盖凝血因子II、V、VII、X、XII、XIII缺乏、F5F8D及VKDFD八种疾病，涉及到11个基因。<br>　　2．分析了血友病A、血友病B、及遗传性FXI缺陷症患者的基因检测结果。218例FVIII缺陷症患者检测出123种F8基因突变，其中33种国内外尚未报道。86例血友病B患者检测出64种F9基因突变，11种国内外尚未报道。56例血友病C患者共发现了40种F11基因突变，其中15种国内外尚未报道。对中国人群血友病患者基因突变谱进行了描述，新发现的突变补充了相应疾病的基因突变库。