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胃肠间质瘤中长链非编码RNA的表达谱分析及lncRNA-DNM3OS调控胃肠间质瘤恶性进展的功能和机制研究

摘要目的:<br>  胃肠间质瘤(gastrointestinalstromaltumor,GIST)生物学行为多变,可呈良性或恶性表现。既往研究报道长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)能够促进肿瘤的发生、发展和转移,但其对GIST恶性进展的作用及机理尚不明确。本研究旨在筛选出参与GIST恶性进展的lncRNA,以期为GIST提供新的预后生物标志物和治疗靶标。<br>  材料和方法:<br>  应用全转录组测序技术对10对不同恶性程度的GIST肿瘤组织及瘤旁正常组织样本进行检测,筛选出差异表达的lncRNA和mRNA,然后使用WGCNA分析,GO分析和KEGG分析获得相关的分子信息和疾病途径信息;利用Oncomine分析多个差异表达的lncRNA与GIST恶性进展的相关性,进而筛选出候选的lncRNA。<br>  为明确所筛选lncRNA-DNM3OS在GIST中的表达、功能及机理,我们首先利用荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)检测251对GIST组织样本中DNM3OS的表达,并对GIST临床病理特征和预后相关性进行了分析;然后利用核质分离-定量PCR实验及FISH对DNM3OS的亚细胞定位进行检测;其次,构建稳定干扰DNM3OS的GIST细胞系,利用CCK8和细胞免疫荧光染色探究DNM3OS对GIST细胞增殖和核分裂象数的影响;最后,利用RNApulldown实验联合质谱检测寻找与DNM3OS直接结合的蛋白分子,并进行Westernblot验证,利用RNA测序和Westernblot实验探究DNM3OS调控的下游靶基因,构建DNM3OS与下游靶点的调控网络,明确DNM3OS调控GIST恶性进展的分子机制。<br>  结果:<br>  基于改良NIH危险度分级标准,我们将GIST组织样本分为三组:低危GIST(lowrisk,LR,肿瘤直径2–5cm,核分裂象数≤5mitoses/50HPFs),基于肿瘤大小的高危GIST(highriskbasedontumorsize,HBS,肿瘤直径>10cm,核分裂象数≤5mitoses/50HPFs),基于核分裂象数的高危GIST(highriskbasedonmitoticrate,HBM,肿瘤直径2–5cm,核分裂象数>10mitoses/50HPFs)。测序结果显示GIST恶性进展过程中存在一系列差异表达的lncRNA和mRNA。Venn分析显示,分别有37,193和299个lncRNA在LR、HBS和HBM组特异性上调,其中有118个lncRNA在HBS和HBM组共同特异性上调,其可能与GIST恶性进展过程密切相关。KEGG分析显示,HBS和HBM组共同特异性上调的lncRNA主要调控的信号通路为Hippo信号通路,共有45个lncRNA参与调控Hippo信号通路。随后我们对Hippo信号通路中富集到的12个临床相关的lncRNA进行了Oncomine分析,结果显示DNM3OS与胃癌的临床病理特征显著相关。因此,我们选择lncRNA-DNM3OS进行后续实验。<br>  应用FISH技术对251例GIST标本进行DNM3OS表达情况分析,其中高表达108例,低表达143例;临床病理特征相关性分析显示DNM3OS高表达与肿瘤大小、核分裂象数、危险度分级和基因突变类型显著相关;预后分析显示DNM3OS高表达的患者具有较差的无进展生存期(progression-freesurvival,PFS)和总体生存期(overallsurvival,OS)。Ensembl和NCBI基因数据库显示DNM3OS位于人的1号染色体q24.3区域,由4个外显子构成,全长568个核苷酸,是一种反义链lncRNA。CPAT网站预测显示DNM3OS不具备编码蛋白质的能力。核质分离实验和FISH实验显示DNM3OS主要定位于细胞核中。干扰GIST细胞中DNM3OS表达后,GIST882和GIST-T1细胞的增殖能力显著降低,核分裂象数显著减少(P<0.05)。RNApulldown实验联合质谱检测、Westernblot实验结果表明PARP1可与DNM3OS直接结合,是DNM3OS的潜在直接靶点。基于转录组测序、定量PCR和Westernblot的实验结果表明DNM3OS能通过调控PARP1的下游靶点GLUT4和CD36的表达,参与FoxO信号通路,促进GIST的恶性进展。<br>  结论:<br>  GIST恶性进展过程中存在一系列差异表达的lncRNA和mRNA,其可能在GIST恶性进展过程中发挥重要作用。lncRNA-DNM3OS在高恶性度GIST中表达显著高于低恶性度GIST,其表达情况与GIST肿瘤大小、核分裂象数等显著相关,DNM3OS高表达与患者不良预后呈正相关,其有望成为GIST预后判断的分子标志物。干扰GIST细胞中DNM3OS表达可显著抑制细胞的增殖能力和核分裂象数。机制研究表明DNM3OS可通过直接靶向结合PARP1蛋白调控GLUT4和CD36表达,进而参与调控FoxOsignalingpathway,促进GIST恶性进展过程。本研究表明DNM3OS可以作为GIST预后判断的一个潜在分子标志物,为GIST治疗提供新的思路。

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