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摘要背景和目的<br>　　胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤，尽管对患者实施肿瘤全切除、术后同步放化疗、替莫唑胺辅助化疗等当前标准治疗方法，其预后仍然不好。<br>　　胶质瘤的恶性进展可能主要与增殖、凋亡及侵袭等生物行为相关。而转录因子在这些生物过程中发挥着重要作用。FOSL1是AP-1家族转录因子的成员。到目前为止，有关FOSL1的研究已涵盖了人体几乎所有部位的肿瘤，例如，大肠癌，食道癌，肺癌等。FOSL1在各种肿瘤中的异常表达及其对肿瘤的影响因肿瘤的类型而异.FOSL1在胶质瘤中的研究尚少。在胶质瘤发生发展中的作用机制尚不明确。因此，本研究主要从生物信息学、临床标本检测、细胞实验、动物实验等方面探讨FOSL1对胶质瘤中的影响。<br>　　材料和方法<br>　　1.生物信息学分析：利用CGGA，TCGA，Rembrandt公共数据库分析FOSL1在不同胶质瘤组织中的变化；生存分析分别分析FOSL1在CGGA，TCGA，Rembrandt公共数据库中WHOⅡ、WHOⅢ、WHOⅣ级胶质瘤中的预后作用和生存率的预测作用。对上述三个公共数据所获的FOSL1在胶质瘤的预后作用进行荟萃分析。<br>　　2.临床样本检测：共纳入69例胶质瘤组织进行检测FOSL1表达及预后分析。其中35例胶质瘤组织匹配有正常脑组织，用于评估FOSL1在肿瘤组织及正常脑组织中的表达趋势。主要运用RT-qPCR检测方法评估FOSL1在肿瘤及正常脑组织中的表达状态。最后，我们分析FOSL1与胶质瘤临床和总的生存时间的关系。<br>　　3.细胞系的建立：成功构建慢病毒载体，采用转染和筛选等方法建立FOSL1过表达组和对照组的KNS89，FOSL1敲除组和其对照组，利用RT-qPCR，WB等技术分别在mRNA和蛋白水平进行验证。<br>　　4.FOSL1对胶质瘤的作用研究（体内外实验）：成功建立FOSL1相关的KNS89细胞系后，我们采用CCK8、EdU增殖染色实验以及流式技术检测细胞周期来进行评估FOSL1对KNS89细胞增殖的影响；利用细胞划痕实验、Transwell侵袭和迁移实验探讨FOSL1敲除和过表达KNS89细胞的迁移和侵袭能力；为了探讨FOSL1对KNS89细胞凋亡过程的影响，我们进行了Hoechst33258染色实验。此外，我们建立裸鼠胶质瘤原位模型，以肿瘤种植后21天肿瘤大小为主要指标来评估FOSL1的表达状态对KNS89细胞成瘤的影响。我还将FOSL1敲除后KNS89细胞及其对照组细胞进行转录组测序，分析其下游差异性基因及差异性基因的功能。最后，为了探讨FOSL1相关的作用机制，我们通过WB分析pYAP,pPKCa,pAKT473,Vimentin,pERK,S6,ps6,s6k,ps6k,p4EBP1,P38,P62，凋亡相关蛋白以及细胞增殖相关蛋白等蛋白水平在FOSL1敲除及其对照组以及FOSL1过表达及其对照组的组间变化。<br>　　5.FOSL1下游多基因模型建立：我们利用FOSL1敲除的KNS89细胞及其对照组进行转录组测序所得差异性基因（排名前36）在CGGA数据库中进行建模。主要涉及到的方法为lasso回归和nomogram模型建立。根据该模型计算出风险评分，评估风险评分在不同胶质瘤组织、不同胶质瘤级别、不同分子亚型胶质瘤中的分布趋势。此外，还探讨了风险评分与胶质瘤生存时间的关系。最后，进一步分析了高低风险评分间的差异性基因以及这些差异性基因的功能。<br>　　结果<br>　　1.生信分析结果：CGGA，TCGA，Rembrandt公共数据库的生信分析表明FOSL1在原发性和复发性胶质母细胞瘤中的表达要高于间变胶质瘤和低级别胶质瘤，且FOSL1主要与胶质瘤的恶性生物学特征相关。基于CGGA，TCGA，Rembrandt公共数据库的多因素COX回归分析和荟萃分析表明FOSL1高表达是胶质瘤患者预后的危险性因素（胶质瘤、高级别胶质瘤以及胶质母细胞瘤）。<br>　　2.临床样本检测：FOSL1在胶质瘤组织中的表达高于其配对的正常脑组织（p=0.0034）。WHOIV级胶质瘤中FOSL1的表达要明显高于WHOⅡ级及WHOⅢ级胶质瘤（p＜0.05）。与FOSL1低表达的胶质瘤相比，FOSL1高表达的胶质瘤患者生存时间要短（p＜0.05）。<br>　　3.细胞实验和动物模型结果：在细胞水平上，我们首先建立FOSL1敲除的KNS89细胞和其相应的对照组以及FOSL1过表达的细胞组和其相应的对照组。紧接着探讨了FOSL1对KNS89细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等细胞生物过程的影响。EdU细胞增殖染色实验表明FOSL1过表达可促进细胞的增殖（p=0.0146）；在FOSL1敲除则可抑制KNS89细胞增殖（p=0.0220）。流式检测细胞周期结果表明FOSL1敲除后使得S期向G0/G1期转变，从而达到细胞周期停滞的目的（p＜0.05），但FOSL1过表达则对细胞周期无影响。Hochest33258凋亡染色实验表明FOSL1过表达可抑制替莫唑胺促凋亡效应（p＜0.05），与之相反，替莫唑胺孵育FOSL1敲除KNS89细胞则可促进替莫唑胺的促凋亡效应（p＜0.05）。划痕实验表明KNS89细胞24h和48h的愈合速度在FOSL1敲除的细胞系中要低于对照组（p＜0.05）。Transwell迁移和侵袭表明FOSL1敲除可抑制KNS89细胞的迁移和侵袭，反之则可促进迁移和侵袭。裸鼠胶质瘤原位模型结果表明FOSL1敲除组及其对照组的裸鼠体重增长在第九天的时候达到高峰期，达到高峰后两组裸鼠体重便逐渐下降，且FOSL1敲除组体重减少要少于其对照组，两组裸鼠体重在第12天、15天、21天时具有统计学差异。FOSL1敲除组的肿瘤最大横径明显低于对照组（p＜0.05）,这表明FOSL1敲除后可抑制肿瘤的形成，可能通过抑制KNS89细胞增殖、侵袭、迁移以及凋亡相关。<br>　　4.作用机制研究：FOSL1敲除后的KNS89细胞及其对照组转录组测序发现FOSL1下游差异性基因主要与细胞外基质组成、细胞外基质降解、角质化、角质化的形成等相关。我们结合RNA-seq分析结果并选取具有代表性及有文献报道的蛋白进行WB检测，结果发现与对照组相比，在FOSL1敲除的KNS89细胞中，AKT的S473磷酸化,磷酸化的s6,磷酸化的s6k，p4EBP1及CDK1的表达水平下调，而Bcl2,caspase3,cleavedcaspase3则上调，在FOSL1过表达的KNS89细胞中，AKT的S473磷酸化、磷酸化的s6、磷酸化的s6k、CDK1、CylincD1的表达水平上调，而Cleavedcaspase3和Cleavedcaspase9表达水平则下调。<br>　　5.FOSL1下游差异性多基因模型建立：经过lasso回归后，共纳入15个FOSL1下游差异性基因建立模型，根据该模型计算的风险评分（Riskscore）=BGN*(-0.043)+CAST*0.153+CD44*0.066+COL6A2*0.164+COL3A1*0.039+COL6A1*(-0.147)+COL15A1*(-0.249)+COLGALT2*(0.095)+HSPG2*0.225+ITGA3*0.032+ITGB5*(-0.090)+LAMC3*(-0.099)+MMP2*0.009+MMP14*0.227+P4HA3*(-0.310).我们发现复发和继发胶质瘤中的风险评分主要与胶质瘤恶性特征有关。多因素COX回归分析结果表明基于FOSL1下游差异性基因所得风险评分是所有胶质瘤、WHOⅡ级胶质瘤、WHOⅢ级胶质瘤、WHOⅣ级胶质瘤的预后独立预测因子，其相应的调整后的风险比和95%置信区间分别为1.733（95%CI:1.464-2.052）、2.366（95%CI:1.503-3.726）、1.862（95%CI:1.408-2.462）、1.469（95%CI:1.158-1.863）。我们使用CGGA进行的内部验证结果表明该模型的预测作用比较稳定。GO和KEEG分析表明这些据风险评分而富集的差异性基因主要与细胞外基质、细胞外结构组成有关。<br>　　结论<br>　　1.FOSL1在胶质瘤组织中的表达是上调的，且FOSL1与胶质瘤的恶性生物特征相关。FOSL1是胶质瘤预后的独立预测因素。<br>　　2.FOSL1敲除和过表达分别能够抑制和促进KNS89细胞的增殖、迁移、侵袭，而FOSL1敲除和过表达则分别能够促进和抑制替莫唑胺诱导的KNS89胶质瘤细胞凋亡，这些生物学作用可能是通过调控CKD、CylincD1、caspase3、cleavedcaspase3、cleavedcaspase9以及mTOR信号通路有关。<br>　　3.转录组测序及GO功能富集分析表明FOSL1主要与细胞外基质组成、细胞外机制降解、角质化、角质化的形成、调控胰岛素样生长因子及胰岛素样生长因子受体的转运和结合以及后转录蛋白的磷酸化调控等。<br>　　4.基于FOSL1下游差异性基因的多基因模型表明风险评分与胶质瘤的恶性生物学特征相关。高风险评分是胶质瘤预后的危险性因素。风险评分对胶质瘤的生存率有着较好的预测能力。