生命早期LPS暴露对OVA诱导的BALB/c小鼠呼吸道过敏性炎症反应的影响及机制研究-论文-万方医学网

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生命早期LPS暴露对OVA诱导的BALB/c小鼠呼吸道过敏性炎症反应的影响及机制研究

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摘要第一部分致敏期LPS处理对OVA诱导的新生鼠呼吸道过敏性炎症反应的影响及机制研究 　　背景： 　　支气管哮喘（简称哮喘）是一种高度异质性慢性呼吸道炎症性疾病。临床分型复杂多样，其中过敏性哮喘为最常见类型，又称嗜酸粒细胞浸润型哮喘，由Th2细胞介导的呼吸道过敏反应，伴随血清高IgE，杯状细胞化生和呼吸道高反应性，大部分儿童哮喘均属于过敏性哮喘。卫生假说提示：发达国家哮喘患病率增加，是由于婴幼儿时期微生物暴露机会减少所致。新生期/婴幼儿期是过敏性疾病发病的重要“时间窗”，目前认为，该时期如果接触相应的病原体或其相关成分（如脂多糖lipopolysaccharide，LPS），可影响机体后续对过敏原的反应性。目前关于LPS对过敏性哮喘的影响尚存争议，且多应用成年鼠模型进行研究。LPS对于新生鼠模型是否具有保护性，其保护机制与成年鼠是否相同，尚待阐明。 　　目的： 　　致敏期LPS处理对新生鼠和成年鼠OVA诱导的呼吸道过敏性炎症的影响及机制研究。 　　方法： 　　1.不同年龄组OVA诱导的过敏性哮喘模型的建立：致敏期：于第0天和第7天经腹腔按每20g体重给予BALB/c新生鼠（7日龄，新生组）和成年鼠（7周龄，成年组）100μlOVA/alum混悬溶液（含20μgOVA和4mgAlum）；激发期：从第14天开始，每天雾化吸入1%OVA溶液30min，连续雾化5天，阴性对照组雾化同等时间的生理盐水； 　　2.LPS处理：每次OVA/alum致敏前1h分别经腹腔给予两年龄鼠50μl生理盐水（含有1μgLPS）预处理，对照组给予同等量的生理盐水； 　　3.呼吸道过敏性炎症反应的检测：最后一次雾化24h后，获取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF），其中细胞进行瑞氏-姬姆萨染色和分类计数；ELISA检测BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17A和IFN-γ水平以及血清总及OVA-特异性IgE和IgG1水平；肺组织切片行过碘酸雪夫氏染色（periodicAcid-Schiffstain，PAS）和苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosinstaining，HE），观察杯状细胞化生和炎性细胞浸润情况并进行病理评分； 　　4.肺组织及引流淋巴结的免疫学检测：最后一次雾化24h后，部分肺组织经胶原酶D消化后制成单细胞悬液，采用流式细胞术（flowcytometry，FCM）检测嗜酸粒细胞、T细胞及树突状细胞（dendriticcell，DC）组成；分离获取支气管旁淋巴结（peribronchiallymphnodes，PBLN）细胞，进行细胞计数并体外与OVA共培养3天，ELISA检测培养上清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17A和IFN-γ的水平； 　　5.腹腔灌洗及腹腔微环境免疫学检测：经腹腔分别给予新生鼠和成年鼠1ml和5mlPBS，获取腹腔灌洗液（peritonealcavitylavagefluid，PLF），FCM技术检测腹腔免疫细胞的组成和表型；ELISA技术检测PLF中危险信号（尿酸、IL-33和IL-1β）、趋化因子（CCL-2、CCL-5、CCL-11和IL-5）及细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-12和IFN-γ）水平。 　　结果： 　　1.经OVA致敏和激发后，两个年龄组均出现典型呼吸道过敏性炎症，表现为嗜酸粒细胞数目增多、Th2相关细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）水平升高并伴随气管/血管周围炎性细胞浸润及气管杯状细胞化生和黏液分泌增加，血清IgE和IgG1水平明显增加。新生组嗜酸粒细胞数目、Th2型细胞因子水平及OVA特异性IgE水平均明显高于成年鼠； 　　2.致敏期LPS处理可明显削弱两年龄组Th2细胞应答及其介导的呼吸道过敏性炎症。年龄组间的差异主要表现为：LPS处理仅在成年组出现IL-17A水平升高，而对新生组无影响；气管/血管周围炎性细胞浸润仅在新生组明显降低，而在成年组无差异； 　　3.LPS处理在两个年龄组均导致PBLN细胞与OVA共培养上清中Th2相关细胞因子水平明显下降，IFN-γ水平明显增加。而IL-17A水平升高仅见于成年组； 　　4.稳态下，两年龄组腹腔免疫细胞占比不同，新生鼠腹腔巨噬细胞占主导约为67.3%，而成年鼠腹腔B细胞占主导约为60.2%； 　　5.LPS处理对两个年龄组腹腔免疫细胞影响的差异集中在炎性单核细胞。新生组经LPS处理后，腹腔浸润的炎性单核细胞数目显著下降，成年组则无影响。LPS处理均可显著增加两个年龄组单核细胞内IFN-γ的mRNA水平；LPS处理导致腹腔灌洗液中IL-6、IL-12和IFN-γ水平显著增加。另外，LPS处理可致两年龄组嗜酸粒细胞数目明显减少及中性粒细胞增多。 　　结论： 　　1.新生鼠和成年鼠经OVA致敏和激发后，均出现典型的呼吸道过敏性炎症反应，且新生鼠更强； 　　2.LPS处理几乎完全抑制了新生组Th2应答，而对成年组在削弱Th2应答的同时，引起Th17偏移和中性粒细胞浸润； 　　3.LPS处理分别通过减少新生组腹腔中单核细胞数目和影响成年组单核细胞的功能，削弱其促Th2分化的功能； 　　4.LPS处理可增强成年鼠腹腔免疫微环境中与Th1和Th17分化相关细胞因子的表达。 　　第二部分生命早期呼吸道LPS暴露对OVA诱导的呼吸道过敏性炎症反应的影响及机制研究 　　背景： 　　课题组前期工作已成功复制“农场效应”，发现新生鼠LPS预暴露可抑制后续OVA诱导的呼吸道过敏性炎症的发生。为寻找介导农场效应的关键分子，在本部分研究中，我们首先收集LPS预暴露后的肺组织进行RNA测序，发现免疫应答基因1（Immuneresponsivegene1,irg1）表达明显升高。IRG1是线粒体相关酶，负责催化三羧酸循环中间产物顺乌头酸脱羧产生衣康酸。IRG1/衣康酸轴是新近发现的在巨噬细胞“内毒素耐受”中发挥重要负调控作用的分子。基于此，我们猜测衣康酸可能是LPS暴露发挥保护作用的关键分子。衣康酸能否渗透细胞膜尚存争议，为此我们在本部分研究中应用衣康酸类似物，衣康酸二甲酯（Dimethylitaconate，DMI），在OVA激发期进行干预，以研究DMI的作用和机制。 　　目的： 　　1.分析生命早期LPS预暴露所致的肺组织转录组变化； 　　2.根据转录组数据，发现IRG1的表达增高，继而研究激发期DMI处理对新生鼠OVA诱导的呼吸道过敏性炎症反应的影响及机制。 　　方法： 　　1.LPS预暴露模型的建立及检测指标：BALB/c新生鼠每隔1天经鼻给予100ngLPS，共6次。待小鼠成年后（约9周），获取小鼠肺组织，进行RNA测序； 　　2.OVA诱导的新生鼠哮喘模型的建立：同第一部分； 　　3.衣康酸二甲酯（DMI）处理：于OVA初次激发前24h和每次OVA激发前1h，按1.1mg/g体重剂量经腹腔给予DMI； 　　4.体内实验检测指标： 　　a)呼吸道炎症反应检测：同第一部分； 　　b)FCM检测BALF中和肺组织中免疫细胞的组成、分群和功能标志； 　　c)ELISA检测BALF中上皮来源细胞因子及糖酵解终产物乳酸水平； 　　d)肺组织切片进行NRF2免疫组织化学染色并进行支气管上皮细胞核内NRF2累积评分； 　　5.WB和荧光定量PCR检测肺组织NRF2、HO-1和Nqo-1的表达。 　　6.体外实验及检测指标： 　　a)DMI对巨噬细胞M2极化的作用：分离获取3w龄BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞，与0.25mMDMI共孵育1h后加入rmIL-4使其终浓度为（20ng/ml），继续培养24h。FCM技术检测巨噬细胞M2极化指标CD206的表达，荧光定量PCR技术检测M2型巨噬细胞标记物Arg1、Fizz1、Ym1、Mgl1、Mgl2和转录因子PPAR-γ的表达； 　　b)DMI对T细胞活化的作用：分离获取3w龄BALB/c小鼠脾脏初始CD4+T细胞，anti-CD3/CD28刺激，并与不同浓度梯度的DMI共孵育。24h后检测细胞裂解液中GAPDH酶活性及共培养上清中乳酸水平，72h后FCM技术检测T细胞表面CD44和CD25表达； 　　c)DMI对Th2细胞分化的作用：分离获取3w龄BALB/c小鼠脾脏初始CD4+T细胞，anti-CD3/CD28刺激，在Th2分化条件下与不同浓度（0.15mM和0.25mM）DMI共孵育6d，FCM技术检测胞内细胞因子（IL-5和IL-13）的表达。 　　结果： 　　1.生命早期呼吸道LPS预暴露可引起肺组织高表达IRG1； 　　2.激发期DMI处理可明显抑制BALB/c新生鼠OVA诱导的过敏性呼吸道炎症； 　　3.DMI处理可明显抑制2型应答，表现为肺组织M2巨噬细胞和ILC2数量减少、PBLN细胞总数及培养上清中Th2细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）明显降低以及肺组织中Th2细胞数量明显减少； 　　4.DMI处理组肺组织CD11b+DCs数目明显减少，其表面OX40L的表达亦降低； 　　5.DMI处理组鼠肺支气管上皮细胞核内NRF2累积及其平均荧光密度增加，并伴随肺中NRF2和HO-1及Nqo-1表达增加； 　　6.体外实验DMI处理可降低CD206+巨噬细胞和M2极化标记物（Arg1、Fizz1、Ym1、Mgl1和Mgl2）的表达，伴随PPAR-γmRNA表达降低； 　　7.体外实验DMI处理可呈剂量依赖性降低T细胞数量、活化及Th2分化，伴随GAPDH酶活性及乳酸水平均明显降低。 　　结论： 　　1.生命早期LPS预暴露可激活IRG1/衣康酸轴； 　　2.激发期DMI处理可削弱BALB/c新生鼠呼吸道过敏性炎症； 　　3.在体实验发现DMI处理对过敏性哮喘中发挥致病作用的免疫细胞均显示抑制作用，如呼吸道上皮细胞、DC、ILC2、M2及Th2细胞等。这些作用可能是DMI的直接作用，亦可能是间接作用； 　　4.体外实验发现DMI对M2极化、T细胞活化及Th2分化均可发挥直接作用； 　　5.DMI可能通过激活NRF2、抑制糖酵解通路及抑制PPAR-γ等机制发挥作用。