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摘要肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率逐渐呈上升趋势。其治疗策略主要包括手术、肝移植和药物治疗等，其中化学药物治疗仍占据主导地位。为克服化疗的高副毒作用、低选择性等限制，纳米靶向给药系统的构建逐渐成为研究热点，其可改善难溶性药物的溶解度，提高药物在肿瘤内部蓄积及生物利用度，增效减毒。在诸多纳米材料中，多糖具备来源广、廉价易得、毒性低、基团丰富易于修饰等特点，在构建药物递送系统领域取得了越来越广泛的关注。<br>　　当归（Angelicasinensis（Oliv.）Diels）是我国传统药食两用的伞形科当归属草本植物，具有活血补血、润肠通便等多种药理作用，有数千年临床应用历史。当归多糖（Angelicasinensispolysaccharides）是当归中的有效成分之一，具有增强免疫、肝脏保护、抗肿瘤等多种药理活性；此外，当归多糖水溶性好、廉价易得且易于修饰，符合制备药物载体的要求。但目前对当归多糖的研究多集中在对其药理作用的发掘，而利用当归多糖制备药物载体的研究鲜有报道。由于多糖糖链含有丰富的官能团，因此对其疏水修饰合成两亲性聚合物，通过该聚合物在水溶液中的疏水作用力自聚集形成胶束，是构建多糖药物载体最常用的方式之一。常用的疏水基团包括线形小分子疏水基团（硬脂酸等），环状小分子疏水基团（胆固醇，脱氧胆酸等）以及高分子聚合物材料（PLGA等）等。<br>　　本研究以道地药材岷县当归为原料，通过水提醇沉和色谱柱纯化的方法得到水溶性当归多糖ASP，通过光谱和色谱等方法鉴定其纯度。首先引入线形小分子硬脂酸（SA）疏水修饰ASP，通过自组装制备聚合物胶束ASP-SA并包载姜黄素（CUR），该胶束能够显著提高CUR的溶解度和稳定性，同时富集于肝癌HepG2细胞中，增强CUR的抗肿瘤效果。课题组前期研究发现ASP结构中含有大量半乳糖，且ASP可通过去唾液酸糖蛋白受体（半乳糖受体，ASGPR）介导的内吞途径进入肝实质细胞；而ASGPR同样分布在肝癌细胞表面，因此推测疏水修饰后的ASP仍可以通过受体介导的特异性内吞途径进入肝癌细胞；引入环状小分子脱氧胆酸（DOCA）疏水修饰ASP并利用阿霉素（DOX）作为疏水抗肿瘤药物制备载DOX的聚合物胶束，探究其理化性质、靶向能力及体内外抗肿瘤效果，发现该胶束可以被HepG2细胞表面的ASGPR特异性识别并结合内化，增加药物在肝癌组织的浓度，从而提高抗肿瘤效果；为简化制备过程，保持ASP结构完整性，采用两种方法制备了ASP修饰的聚乳酸羟基乙酸（PLGA）纳米粒并对特异性多靶点抗肝癌药物索拉非尼（SOR）进行包载，发现ASP修饰的两种PLGA纳米粒仍可通过特异性结合ASGPR富集于肝癌细胞及多细胞肿瘤球中，抗肿瘤效果显著强于载药PLGA纳米粒。综上所述，本文提纯了精制ASP，利用ASP的天然靶向性和人肝癌细胞高表达的受体，通过多种方式构建基于ASP的纳米药物载体，探究ASP作为抗肿瘤药物载体的可行性，并对其靶向性和抗肿瘤活性进行探索。本文主要研究内容概括如下：<br>　　第一部分水提当归多糖的精制及硬脂酸改性当归多糖自组装纳米药物载体的研究<br>　　本部分实验采用岷县当归作为原材料，采取水提、碱沉、酸调、醇沉、透析法和色谱柱纯化得到分子量均一的精制当归多糖ASP。其糖含量约为90%，不含蛋白质、核酸等杂质，采用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测得ASP重均分子量约为8×104Da。本部分实验构建起一种安全高效低成本的提纯ASP的方法。<br>　　首先采用线形小分子硬脂酸SA作为疏水基团修饰ASP合成ASP-SA两嵌段聚合物，在水中利用疏水作用力自组装形成聚合物胶束。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振氢谱（1H-NMR）、X射线衍射（XRD）等方法证明了ASP-SA的成功合成。通过透析法制备的ASP-SA聚合物胶束水合粒径为402±9.17nm，Zeta电位为-14.9±0.513mV，电镜下呈球形或椭球型。其临界胶束浓度（CMC）约为0.01mg/mL，具备良好的自聚集行为。<br>　　采用姜黄素（Curcumin，CUR）作为模型药物，通过透析法将其载入ASP-SA的疏水内核中，形成“绿色”胶束：其中ASP和CUR为植物提取物，SA广泛存在于动植物油脂中。XRD和FTIR结果证实CUR成功包载于疏水内核中，并呈现良好的缓控式及pH依赖性释放。通过紫外分光光度计对游离CUR和载CUR聚合物胶束（CUR/ASP-SA）的稳定性进行考察，发现ASP-SA可以保护CUR不受光、热影响，显著提高CUR的光、热和贮存稳定性。<br>　　通过细胞毒性和肿瘤球实验证明空白载体对人宫颈癌细胞Hela细胞和人肝癌细胞HepG2细胞安全无毒。利用CUR自身荧光，通过激光共聚焦显微镜考察CUR/ASP-SA和CUR的细胞摄取及在HepG2肿瘤球中的药物渗透，将CUR包载于ASP-SA胶束中不但明显增加药物在HepG2单层细胞中的蓄积，还可以显著提高药物在多细胞肿瘤球的渗透能力，其细胞毒性也明显强于游离的CUR。结合课题组前期研究，推测HepG2细胞对CUR/ASP-SA存在其他的摄取途径。<br>　　第二部分脱氧胆酸改性当归多糖作为肝癌靶向纳米药物载体的研究<br>　　本部分采取环形小分子疏水基团脱氧胆酸（（DOCA）修饰ASP合成两亲性聚合物ASP-DOCA，通过FTIR，1H-NMR，XRD和DSC研究该聚合物表征，证明其成功合成，其CMC为0.005mg/mL，低于ASP-SA的0.01mg/mL，具备更优秀的自聚集性能。利用阿霉素（DOX）为模型药物制备载药胶束（DOX/ASP-DOCA）并验证了DOX的成功包载。通过DLS、TEM和SEM分析载药胶束粒径和形态学表征：DLS结果表明空白和载药胶束的粒径在210~250nm之间，电位约为-17mV，TEM和SEM证实了聚合物胶束呈球形，无聚集。相对于游离DOX的迅速释放，将其包载于胶束中实现了药物的pH依赖性缓控式释放。<br>　　本文第一部分推测HepG2细胞对CUR/ASP-SA存在特异性摄取途径；课题组前期研究发现的ASP结构中含有大量半乳糖，可以通过与分布在肝实质细胞表面的受体ASGPR特异性结合经受体-配体途径内化进入细胞，同时ASGPR也在人肝癌HepG2细胞表面高表达。通过CLSM和流式细胞术进行细胞摄取研究，验证了HepG2细胞对DOX/ASP-DOCA的摄取显著强于同法制备的载DOX的葡聚糖脱氧胆酸聚合物胶束DOX/DEX-DOCA。同时发现ASGPR拮抗剂NGA能竞争性抑制HepG2细胞对DOX/ASP-DOCA的摄取，该现象在Hela细胞中并未出现。说明DOX/ASP-DOCA能够通过ASGPR介导的内吞途径被HepG2细胞特异性识别并高效摄取。建立HepG2荷瘤裸鼠模型，以DIR为荧光探针包载于ASP-DOCA中，通过小动物活体成像评价胶束的肝癌靶向性，结果表明相比于NGA拮抗组，DIR/ASP-DOCA在肿瘤组织内部有更多的蓄积量，且明显多于游离DIR，在体内水平验证了ASP-DOCA的主动靶向能力。<br>　　溶血实验表明ASP-DOCA胶束在非溶血范围内；对HepG2细胞、Hela细胞及体外HepG2多细胞肿瘤球无生长抑制作用；同时空白胶束组小鼠体重变化及肿瘤生长无影响，且对主要器官无明显毒性，体内外结果证实该载体安全无毒。体外毒性实验中，DOX/ASP-DOCA组对HepG2单层细胞及HepG2多细胞肿瘤球的增殖抑制作用明显高于DOX/DEX-DOCA。采用HepG2荷瘤裸鼠模型进行体内药效学评价，发现DOX/ASP-DOCA对HepG2移植瘤的生长抑制作用明显优于游离的DOX和DOX/DEX-DOCA组，切片结果表明游离DOX组和DOX/ASP-DOCA组肿瘤细胞凋亡程度最高，肿瘤组织坏死最严重；同时DOX所带来的体重下降和心脏毒性得到缓解。以上结果说明DOX/ASP-DOCA可通过与ASGPR特异性结合主动靶向肝癌细胞，完成在肿瘤组织内的药物蓄积，在增强DOX抗肿瘤效果的同时降低游离药物的毒副作用。<br>　　第三部分当归多糖修饰的PLGA纳米粒作为肝癌靶向纳米药物载体的研究<br>　　利用静电吸附制备载体时能保持多糖结构；而通过高分子聚合物共价修饰多糖时反应位点较少，可最大程度保证多糖结构完整性。本部分以PLGA为骨架，分别采用静电吸附和共价连接的方式制备两种ASP修饰PLGA纳米粒：（1）ASP/Chi/PLGA纳米粒：通过乳化溶剂挥发法制备带正电的壳聚糖PLGA纳米粒Chi/PLGA，利用ASP结构中含糖醛酸从而带负电的特性将其吸附在Chi/PLGA纳米粒表面制备ASP/Chi/PLGA纳米粒。当Chi浓度为0.1%，ASP浓度为1mg/mL时，其粒径大小为208.3±2.740nm，电位为-13.8±0.361mV。TEM中存在清晰的膜结构，结合粒径增加和电位反转，证明了ASP的成功修饰。（2）ASP-PLGA纳米粒：ASP共价修饰的PLGA纳米粒制备方法和前两部分相似，利用共价键将ASP连接到PLGA上形成双嵌段共聚物ASP-PLGA，通过FTIR，1H-NMR证明该聚合物成功合成。通过透析法制备纳米粒，该纳米粒粒径为146±1.83nm，PDI为0.138±0.334。两种方法制备的纳米粒在电镜下均呈球形，分布均匀。采用临床一线抗肝癌药物索拉非尼（Sorafenib，SOR）作为模型药物，同样分别通过乳化溶剂挥发法和透析法制备载SOR纳米粒SOR@ASP/Chi/PLGA和SOR@ASP-PLGA，测定在不同投药比下包封率和载药量，并进行药物释放研究，体外释药结果表明两种纳米粒中SOR均具备良好的缓释效果。<br>　　以香豆素6（（Coumarin6，C6）作为荧光探针包载到两种纳米中，通过CLSM观察HepG2细胞和Hela细胞对两种纳米粒的摄取，Hela细胞对几种纳米粒的摄取并无明显区别，而ASP/Chi/PLGA和ASP-PLGA在HepG2细胞蓄积明显多于PLGA纳米粒，且在HepG2多细胞肿瘤球中的渗透深度也显著高于PLGA纳米粒，说明两种ASP修饰的PLGA纳米粒可以和HepG2细胞表面的ASGPR特异性结合主动靶向肝癌细胞，从而提高胞内药物浓度。<br>　　溶血实验证实ASP-PLGA和ASP/Chi/PLGA纳米粒具备良好的血液相容性。且ASP/Chi/PLGA和ASP-PLGA纳米粒对Hela细胞、HepG2细胞的增殖及HepG2多细胞肿瘤球的生长均无抑制效果，生物相容性高。通过毒性试验研究SOR、SOR@PLGA、SOR@ASP/Chi/PLGA及SOR@ASP-PLGA纳米粒对HepG2细胞和Hela细胞的细胞毒性：两种载药纳米粒对肿瘤细胞的杀伤作用均具备明显的时间和剂量依赖性。对Hela细胞而言，几种载药纳米粒毒性无显著区别；但对于HepG2单层细胞，SOR@ASP/Chi/PLGA及SOR@ASP-PLGA相较于SOR@PLGA表现出更强的生长抑制作用；同时，相较于游离SOR和SOR@PLGA纳米粒，ASP修饰的两种载药PLGA纳米粒更能抑制HepG2多细胞肿瘤球的生长。该结果与细胞摄取结果相一致，进一步证实了ASP修饰的两种纳米可通过特异性识别结合ASGPR高效富集于HepG2细胞中。考虑到载药纳米粒的药物释放并不完全，SOR@ASP/Chi/PLGA及SOR@ASP-PLGA在实际应用过程中有望表现出更强的抗肿瘤效果。<br>　　综上所述，本研究分离提纯了当归多糖ASP，利用不同的策略构建了几种基于ASP的载体并包载不同的疏水性抗肝癌药物，研究载体的表征、理化性质、药物包载、体内外摄取和毒性。利用ASP主动靶向肝细胞癌的能力提高药物在细胞内的浓度，增强药物的利用率和治疗效果，减轻毒副作用，为设计制备基于当归多糖的药物载体系统提供了思路。