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摘要Yin Yang1(YY1)是一个重要的多功能转录因子，在多种实体肿瘤中高表达，在癌症的发生和发展中发挥着重要调节作用。随着近些年研究的深入，YY1作为肿瘤治疗靶点的潜质也渐渐得到了更多的关注与认同。一般情况下，在转录水平，YY1与带有其结合位点的启动子结合，招募p300,EZH2,HDACs等多种组蛋白修饰酶，通过调节染色质重构进而调控基因表达。在蛋白水平，YY1通过位于氨基酸201-226之间的OPB(oncoprotein binding)区域结合MDM2，促进其介导的p53泛素化降解；也通过OPB区域结合AKT，并促进其通过S473位点磷酸化的激活。近几年，YY1二聚体的形成被相继报道，YY1的二聚体能够促使染色质成环，拉进相隔较远的增强子与启动子来调控基因表达。这些发现提出了YY1调节基因表达的新模式。<br>　　本论文针对YY1二聚体形成的分子机理进行了创新性探索，主要研究结果包括：<br>　　1.鉴定YY1蛋白负责分子间相互作用的区域：首先，将YY1野生型(wt)及其截短突变体的重组蛋白进行原核表达与纯化，通过体外蛋白质互作实验，初步确定了负责YY1分子间相互作用的区域主要集中在YY1蛋白的中后段。然后，利用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术确定了YY1的OPB区域和锌指(zinc finger,ZF)区域参与了YY1分子间相互作用。<br>　　2.确定YY1分子间相互作用的结合模式：构建了带有不同标签的YY1(wt)及其截短突变体的真核表达载体，利用细胞转染及免疫共沉淀方法，确定了同源区域间的相互结合是YY1单体间相互作用的主要模式。由于ZF区域负责与DNA结合，并在介导蛋白间相互作用中存在非特异性，因此，OPB区域负责YY1分子间的特异结合。在以下实验中，主要利用YY1(?ZF)研究其分子间相互作用。<br>　　3.鉴定YY1具有形成寡聚体的分子特性：在评价带有OPB肽段的融合蛋白如何影响YY1分子间相互作用的免疫共沉淀实验中，OPB肽段的增加促进了YY1(?ZF)二聚体或多聚体的形成。与此相符，在体外实验中，化学合成的OPB肽段也能够促进重组YY1(?ZF)在非变性聚丙烯凝胶电泳中形成高分子量的寡聚体。<br>　　4.鉴定决定YY1寡聚体形成的关键性氨基酸：首先，利用SWISS-MODEL,ZDOCK和COOT等分子模型运算法则对OPB区域进行双分子的对接模拟，预测OPB分子间相互作用可能受到8个疏水性氨基酸残基的调节。根据两个拟合度最高的模拟构象进行了疏水性侧链的对接分析，选出了包括I212,L215和F219三个可能影响YY1分子间聚合的疏水性氨基酸。构建了四个YY1(?ZF)突变体I212A,L215A,F219A和3A(即三个疏水性氨基酸同时突变的突变体)。利用免疫共沉淀的方法，确定了OPB区域的F219在YY1寡聚体形成中发挥了决定作用。<br>　　5.揭示了YY1寡聚体形成对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响：在乳腺癌MDA-MB-231,MDA-MB-453和MCF-7细胞中，利用靶向于YY1mRNA3’-UTR的shRNA敲低内源YY1，然后，通过慢病毒侵染，在这些细胞内稳定表达YY1野生型(wt)及突变体，并检测所获得的细胞的增殖及迁移能力。结果表明，失去寡聚能力的YY1(F219A)和YY1(3A)突变体显示出比YY1(wt)更强的促进乳腺癌细胞增殖和迁移的能力。<br>　　6.探究失去寡聚能力的YY1突变体比YY1(wt)有更强促增殖能力的分子机制：根据以往报道，YY1的OPB区域能够结合癌蛋白EZH2,AKT和MDM2并促进他们的活性。在免疫共沉淀实验中,与YY1(wt)相比，YY1(F219A)和YY1(3A)与EZH2和AKT结合能力增强，但与MDM2结合能力减弱。因此，我们推测，YY1寡聚化能力的丧失，使得细胞内单体YY1的数量增多，因而也增加了YY1与EZH2和AKT的结合机会，进而促进了这两个癌蛋白所调控的促癌信号通路，增强了乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。<br>　　综上所述，本研究首先鉴定了OPB区域是促进YY1分子间相互作用的主要区域。进而发现疏水性氨基酸F219为该区域中决定YY1聚合体形成的关键性氨基酸，并进一步揭示了YY1寡聚体的形成与YY1对EZH2和AKT等癌蛋白的结合及调控存在的竞争关系。这项研究为深入了解YY1在染色质层面的转录调节机制提供了直接的实验依据，同时也为YY1可以作为肿瘤治疗的新靶点提供了新的理论依据。