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摘要远志皂苷元（Senegenin，SEN）是一种从我国传统中药远志（Polygalatenuifolia）中提取的活性成分，具有保护线粒体、抵抗神经元死亡的作用。Aβ1-42寡聚体具有神经毒性，可对线粒体造成严重损伤，并且与多种神经退行性疾病密切相关。细胞通过线粒体自噬（Mitophagy）对受损线粒体进行选择性清除，这一过程主要受PTEN诱导激酶1（PTEN-inducedputativekinase1，PINK1）/Parkin途径的调控。有研究报道远志皂苷可上调自噬通路上游调控因子AMPK（AMP-activatedproteinkinase），促进自噬发生。此外，研究显示调控抗衰老经典基因Klotho，可增强自噬清除Aβ，改善细胞线粒体结构、功能及机体认知缺陷。胰岛素样生长因子（Insulin-likegrowthfactor1，IGF-1）可通过抑制AMPK激酶区域活性中心Thr172的磷酸化抑制其活性。由于Klotho能够通过负调控IGF-1间接调节自噬，作者推测SEN可通过线粒体自噬减轻Aβ1-42寡聚体引起的神经元损伤，该过程与Klotho/IGF-1/AMPK途径有关。<br>　　本研究在活体实验中用SEN（3.6μg/g、7.2μg/g、14.4μg/g）对侧脑室注射Aβ1-42寡聚体的C57BL/6小鼠进行灌胃干预，在体外实验中用SEN（10μM、20μM、40μM、60μM）处理Aβ1-42寡聚体诱导损伤的小鼠海马神经元HT22细胞，结合线粒体自噬抑制剂环孢素（CyclosporinA，CsA）研究SEN能否通过线粒体自噬减轻Aβ1-42寡聚体诱导的神经元损伤；再利用慢病毒感染HT22过表达Klotho，探讨Klotho/IGF-1/AMPK途径在SEN诱导线粒体自噬中的作用，为深入了解SEN的神经保护作用和线粒体自噬调控机制提供更全面的理论支持，同时为中药远志防治神经退行性疾病的临床用药提供实验基础。<br>　　本论文取得以下研究结果：<br>　　1.Aβ1-42寡聚体导致小鼠海马神经元损伤。（1）体外实验中，30μMAβ1-42寡聚体处理小鼠海马神经元HT22细胞24h可显著降低细胞活力（plt;0.05），增高乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase，LDH）释放量（plt;0.05），降低线粒体膜电位（Mitochondrialmembranepotential，MMP）（plt;0.05），产生过量活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）（plt;0.05），造成线粒体嵴模糊、结构混乱，并诱导细胞凋亡（plt;0.05）。（2）活体实验中，侧脑室注射Aβ1-42寡聚体可造成小鼠海马体神经元MMP显著下降（plt;0.05），细胞凋亡率显著升高（plt;0.05）。<br>　　2．SEN减轻Aβ1-42寡聚体引起的小鼠海马神经元损伤。（1）体外实验中，用不同浓度SEN处理Aβ1-42寡聚体诱导损伤的HT22细胞24h，与诱导损伤组相比，20μM和40μMSEN处理组的细胞活力显著上升（plt;0.05）且MMP显著升高（plt;0.05），20μMSEN可显著降低细胞凋亡率（plt;0.05）和ROS含量（plt;0.05）。（2）活体实验中，用不同剂量SEN灌胃干预侧脑室注射Aβ1-42寡聚体的小鼠，与诱导损伤组相比，14.4μg/gSEN干预组的小鼠海马体神经元MMP显著升高（p＜0.05），细胞凋亡率显著降低（p＜0.05）。<br>　　3．SEN诱导Aβ1-42寡聚体致损的小鼠海马神经元发生PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。（1）体外实验中，用20μM、40μMSEN处理Aβ1-42寡聚体致损的HT22细胞24h，促进线粒体自噬体与线粒体自噬溶酶体的形成，自噬标志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著上调（plt;0.05），自噬受体蛋白p62显著下调（plt;0.05），引起全长型PINK1的蓄积（plt;0.05）和Parkin向线粒体的移位及线粒体与自噬体、线粒体与溶酶体的共定位，并且线粒体基质蛋白HSP60的表达下调（plt;0.05）。（2）活体实验中，与诱导损伤组相比，7.2μg/gSEN干预可使LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin表达量显著上调（plt;0.05）；14.4μg/gSEN干预组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达量在显著升高的同时伴随着p62表达下降（plt;0.05），HSP60的含量呈显著下降（plt;0.05），14.4μg/gSEN干预组小鼠海马体神经元中形成线粒体自噬体。<br>　　4．抑制线粒体自噬引起Aβ1-42寡聚体导致的HT22细胞损伤复现。（1）用5μMCsA预处理Aβ1-42寡聚体致损的HT22细胞2h后分别与20μM和40μMSEN联合处理24h。与20μMSEN处理组相比，CsA联合处理组中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和PINK1显著下降（plt;0.05），p62显著上升（plt;0.05）；与40μMSEN处理组相比，CsA联合处理组p62和HSP60含量显著上升（plt;0.05），PINK1蓄积量明显降低（plt;0.05）；CsA联合处理组无线粒体与自噬体、线粒体与溶酶体的共定位及线粒体自噬体的形成。（2）在线粒体网络动态变化中，与诱导损伤组相比，20μM和40μMSEN处理组细胞中的平均单独个体线粒体（Individuals）数量、线粒体网格（Networks）数量和线粒体面积（MitochondrialFootprint）均显著增加（plt;0.05）；与SEN处理组相比，40μMSEN联合CsA处理组细胞的平均单独个体线粒体数量和线粒体网格数量显著减少（plt;0.05），20μMSEN联合CsA处理组细胞内平均线粒体面积显著减少（plt;0.05）。（3）在细胞损伤相关检测中，与20μMSEN处理组相比，CsA联合处理组中细胞活力再次出现显著下降（plt;0.05），LDH释放量和ROS水平显著增加（plt;0.05）；与40μMSEN处理组相比，CsA联合处理组的LDH释放量和ROS含量显著升高（plt;0.05）。<br>　　5．Klotho/IGF-1/AMPK途径参与SEN诱导的线粒体自噬。与诱导损伤组相比，20μMSEN可显著提高Aβ1-42寡聚体诱导损伤的HT22细胞Klotho蛋白水平（plt;0.05）。过表达Klotho的Aβ1-42寡聚体致损HT22细胞与20μM和40μMSEN处理的Aβ1-42寡聚体致损HT22细胞中均发生自噬标志蛋白LC3与p62的表达变化，全长型PINK1蓄积，线粒体基质蛋白HSP60降低，表示线粒体自噬被激活，且IGF-1的表达量下降，AMPKα183/172的磷酸化水平升高。<br>　　综上所述，本研究通过体内、体外实验探明了SEN通过诱导PINK1/Parkin介导的线粒体自噬拮抗Aβ1-42寡聚体导致的神经元损伤，并且此过程可能与SEN提高Klotho蛋白的表达、抑制IGF-1、增强AMPKα183/172的磷酸化有关。本研究首次从线粒体自噬角度揭示远志的药理活性，也对深入探究Klotho与线粒体自噬的关系提供了新的研究视角。