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摘要生物矿化是大自然中广泛存在的一种现象，是指生物体在大分子的调控下离子在有机或者无机模板上形成生物矿物的过程。骨作为天然的生物矿物之一，是由矿化胶原纤维组成的具有多层级结构的有机/无机共混物。有机基质是由胶原和非胶原蛋白（NCPs）组成，无机矿物的主要成分是羟基磷灰石（HAP，Ca10(PO4)6(OH)2），此外还有硅、镁、锶和钠等微量元素的存在，其中硅已经被证明可以促进成骨细胞的增殖、黏附和分化以及骨的形成和发育。通过仿生矿化的方法可以制备接近天然骨组成和结构的矿化胶原材料，将硅引入生物矿化系统中结合纤维内矿化制备掺硅矿化胶原材料用于生物医学领域有着重要的意义。本论文首先探究了系统pH值对胶原自组装同步矿化过程的影响，了解胶原自组装和矿物形成之间的关系并优化体外仿生胶原矿化的基本条件；然后选用硅酸钠作为硅源，研究硅酸钠对于胶原聚集态结构和自组装行为的关系，以此为基础，通过仿生矿化过程制备掺硅矿化胶原材料，系统地研究了材料结构和性能的差异。鉴于骨的多层级结构以纤维内矿化胶原为基础，引入聚丙烯酸（PAA）作为NCPs模拟物，诱导胶原的纤维内矿化。基于此，结合纤维内和纤维外矿化方法制备了具有层级结构的掺硅复合矿化胶原材料，可以为设计和制备组成和结构接近天然骨的材料提供理论指导和科学依据。<br>　　溶液的pH值已经被证明不仅会影响胶原自组装过程，而且会调控HAP的生成速率和含量。在胶原自组装同步矿化系统中，纤维和矿物的形成是同步发生的，探究pH值的影响对了解生物矿化的机理有着重要意义。首先通过Zeta电位分析了pH值（7.9-10.4）对于含有钙和磷的胶原溶液的表面电荷，结果表明pH值的增加可以促进胶原分子表面酸性氨基酸残基上的羧基的电离，增强胶原分子表面的负电荷。然后采用浊度法和X射线衍射（XRD）分析了矿化的过程，发现矿物从无定形状态转变为结晶态会引起吸光度的突然降低，从而在动力学曲线上产生波峰和波谷。并且pH的增加会促进钙离子和-COO-的螯合，导致矿物的结晶从胶原分子自组装的生长期延缓到平台期。红外光谱（FTIR）、XRD和扫描电镜（SEM）分析矿化材料的结构和形貌，发现矿物沉积在纤维的表面，为纤维外矿化，生成的矿物相为低结晶度的HAP，结合热重（TG）和电感耦合等离子发射光谱（ICP-OES）分析发现pH值的增加会促进矿物的形成和结晶，在9.4-10.4的范围内基本不变。通过定量分析羟脯氨酸（Hyp）含量发现当pH值低于8.9时，矿物在胶原分子重排阶段的快速结晶会明显抑制胶原自组装形成纤维，而pH值在9.4-10.4的范围内，矿物的结晶转变发在胶原自组装平台期，胶原纤维形成的过程主要受静电排斥力影响，增加pH值会抑制纤维的形成。采用质构仪和流变仪对矿化后形成的水凝胶的凝胶强度和动态粘弹性分析表明，pH值为9.4时制备的凝胶的强度和弹性模量较好。<br>　　研究硅酸钠对于胶原分子的聚集态结构和自组装行为可以为制备掺硅矿化胶原材料提供理论依据和指导。首先分析了不同浓度（2-8mmol/L）硅酸钠的加入对于胶原结构的影响，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和FTIR分析结果表明硅酸钠的加入不会破坏胶原的三螺旋结构。然后通过芘荧光光谱和动态光散射（DLS）分析了硅酸钠加入后胶原聚集态结构的变化，结果表明低浓度（2mmol/L）硅酸钠的加入会降低胶原溶液微环境极性，增强胶原分子之间的疏水作用，促进胶原的聚集，但是持续增加硅酸钠的浓度会导致微环境极性的增加，促进胶原的分散。采用紫外分光光度计（UV）监测了胶原的自组装过程，发现2mmol/L的硅酸钠可以加快胶原的自组装速率，促进胶原成纤维，主要是由于胶原分子间疏水作用的增强所导致；而当浓度高于4mmol/L时，胶原分子的自组装速率和吸光度的变化随着浓度的增加而降低，说明自组装过程逐渐被抑制。通过SEM和原子力纤维镜（AFM）观察自组装之后的表面形貌发现，4mmol/L的硅酸钠对于自组装的抑制程度较低，仍然可以形成纤维，而6mmol/L以上浓度的硅酸钠会显著抑制胶原自组装形成纤维，以聚集体的形式存在。<br>　　基于硅酸钠对于胶原自组装行为的影响研究，通过胶原自组装同步（FSM）或异步（FBM）矿物形成两种方式制备掺硅矿化胶原材料，并对比其组成、结构和形貌，从而筛选合适的工艺。通过hyp含量分析样品中的胶原含量，结果表明对于FSM方式来说，6mmol/L以上的硅酸钠浓度会抑制胶原纤维的形成，形成的胶原/矿物共混物中胶原纤维含量明显降低；而FBM方式通过延迟分步加入避免了高浓度硅酸钠对于自组装的影响，保证了纤维的形成。采用FTIR和XRD分析了对比了两种样品的结构，发现硅酸钠浓度在4mmol/L以上才能在共混物中有效地掺入硅，并且硅的掺入会抑制HAP的结晶。X射线光电子能谱（XPS）和元素分析（EDS）对硅的掺入进行了验证，并且随着硅酸钠浓度的增加，硅掺入的含量逐渐增加。SEM和透射电镜（TEM）对两种方式制备材料的微观形貌进行了观察，表明矿物主要分布在胶原纤维之间，为纤维外矿化，并且矿物在基质内的分布均一，硅元素的分布也很均匀。硅酸钠浓度的增加，会导致矿物含量逐渐增加，并且逐渐掩盖纤维的结构。特别地，对于FSM方式来说，高浓度的硅酸钠会影响纤维的形成，而FBM矿化中仍然可以观察到完整的胶原纤维，考虑FBM方式对于硅掺入矿化胶原材料构建来说更优。通过CCK-8和激光共聚焦实验可知，发现掺入和未掺入硅的材料具有良好的生物相容性。此外，通过碱性磷酸酶（ALP）活力的测定结果表明加入4mmol/L硅酸钠制备的掺硅矿化胶原材料和未添加硅酸钠的实验组相比更能促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化。<br>　　选用聚丙烯酸（PAA）作为NCPs模拟物，将其引入胶原自组装同步矿化系统，探究其分子量和浓度对于胶原矿化的影响，从而制备均匀的纤维内矿化胶原基质。首先采用Zeta电位、DLS和浊度动力学分析了PAA分子量和浓度对于ACP前驱体的表面电荷和稳定性，结果表明PAA的加入会使得ACP前驱体呈现显著的负电性，随着PAA分子量的增加，由于其长链的结构使得其在水中的运动活力降低，ACP前驱体的稳定性逐渐降低和粒径的逐渐增加；随着PAA浓度的增加，溶液中更多的钙离子被-COO-螯合，导致形成的ACP前驱体的稳定性增加和粒径的降低。采用FTIR和XRD对1、3和7天矿化后的样品的结构进行了分析，结果表明40mg/L的100和450kDa的PAA不能有效地稳定ACP前驱体，1天后就能矿化，而低分子量的PAA可以显著延缓HAP的生成和结晶速度，40mg/L时直到7天才矿化；对于每个分子量来说，提高PAA的分子量也可以延缓HAP的成核和结晶。SEM、TEM和TG分析1、3和7天矿化后的样品的微观形貌和矿物含量，结果发现高分子量的PAA在40mg/L时矿物主要分布在胶原纤维的表面和之间，沿着纤维的长轴方向生长，为纤维外矿化，然而40mg/L的2kDa的PAA可以有效地稳定前驱体，保证其向纤维内渗透和聚集，诱导纤维内矿化。提高PAA的浓度可以促进前驱体向胶原纤维内部渗透，诱导从纤维外到纤维内矿化的转变，但是和分子量密切相关。对于2kDa的PAA，＞80mg/L的浓度会导致前驱体过于稳定，7天后未矿化；100kDa的PAA需要80mg/L以上的浓度，才能实现纤维内矿化；而450kDa的PAA达到120mg/L才能实现纤维内矿化。<br>　　基于前述章节对于掺硅矿化胶原材料和PAA诱导纤维内矿化的研究，采用纤维外或纤维内矿化结合纤维外矿化的方式制备掺硅复合矿化胶原材料。FTIR和XRD结果表明，复合矿化和单一矿化生成的矿物主要为HAP，多步复合矿化不会改变其结构，但是明显增加的HAP吸收峰表明生成的矿物相含量增加；此外，硅的掺入会降低HAP的结晶度，随着硅酸钠浓度的增加，Si-O-Si的TO3、TO2和TO1特征峰强度增加，表明硅掺入的含量增加。通过XPS和EDS对硅的掺入和含量的变化进行了验证，同时Ca、P和Si元素在基质中的分布均匀，表明多步的复合矿化方式不会导致基质的异质矿化。SEM和TEM观察单一和复合矿化材料的微观形貌发现，对于复合矿化的样品，复合的矿化方式使得矿物的含量明显增加，并且随着硅酸钠浓度的增加，矿物含量也有所增加，逐渐覆盖了胶原纤维的形貌。通过先纤维内矿化再纤维外矿化的方式相比纤维外复合纤维外矿化的方式可以实现天然骨骼多层级的结构。通过TG和灰分含量测定表明，复合矿化可显著提高矿化的程度，并且可以提高胶原纤维的热分解温度。综合CCK-8和激光共聚焦实验可知，发现掺入和未掺入硅的材料具有良好的生物相容性，矿物含量的增加会略微增加其毒性。此外，ALP活力的测定结果表明纤维内复合纤维外的材料相比纤维外复合纤维外的材料具有更好的促成骨分化能力，而且硅的掺入也有着促进成骨分化的作用。