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摘要研究背景：<br>　　肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，在目前仍然缺乏有效的治疗方法。由于肝癌治疗药物有限和低应答率，肝癌的临床治疗形势十分严峻。因此，迫切需要新的药物来有效治疗肝癌。“老药新用”即药物再利用是指发现现有药物的新适应症，由于使用已获批临床使用的药物，具有风险低，成本低，开发时间短等特点，利于高效地开发新的肿瘤治疗药物。纳他霉素是一种临床使用的抗真菌药物，也被用作食品添加剂用于抑制霉菌生长。最近纳他霉素被报道能够抑制肿瘤细胞生长增殖，但其抗肿瘤机制尚不清楚。<br>　　研究目的：<br>　　探究纳他霉素的抗肝癌作用以及相关的分子机制，丰富肝癌治疗的基础研究，为其临床治疗提供新策略。<br>　　研究方法：<br>　　1.通过MTT、克隆形成、EdU、LDH释放等实验检测不同浓度纳他霉素处理对肝癌细胞活力的影响。<br>　　2.联用六种不同类型的细胞死亡抑制剂，明确纳他霉素导致肝癌细胞死亡的方式。<br>　　3.通过蛋白质谱实验，分析纳他霉素处理后肝癌细胞中显著变化的蛋白及生物学过程。<br>　　4.检测纳他霉素处理后肝癌细胞内ROS水平的变化情况，联用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）后检测细胞活力。<br>　　5.通过免疫印迹、免疫共沉淀、免疫荧光等实验检测纳他霉素处理对肝癌细胞自噬水平的调控。通过GFP-RFP-LC3串联质粒、LAMP1与LC3B共定位等实验检测自噬流。<br>　　6.将纳他霉素与自噬抑制剂CQ或3-MA联合使用，观察对纳他霉素作用效果的影响。<br>　　7.在肝癌细胞中过表达过氧化物还原酶1（PRDX1）后，观察纳他霉素的作用效果。通过CHX、MG132处理、免疫共沉淀等实验明确纳他霉素导致PRDX1蛋白水平下调的方式。<br>　　8.利用裸鼠皮下移植瘤模型，观察纳他霉素的体内抗肝癌作用效果及其毒副作用。<br>　　研究结果：<br>　　1.纳他霉素显著抑制肝癌细胞活力，对MHCC97H、PLC/PRF/5、Huh7、Hep3B细胞的IC50值为30-40μM。<br>　　2.通过联用六种不同类型的细胞死亡抑制剂，我们发现细胞自噬抑制剂（CQ或3-MA）增强纳他霉素的作用效果，而凋亡抑制剂z-VAD-FMK减弱纳他霉素对肝癌细胞的杀伤作用。<br>　　3.通过蛋白质谱实验以及KEGG通路分析，我们发现纳他霉素处理后细胞内氧化还原过程显著变化。<br>　　4.纳他霉素处理显著提升肝癌细胞内ROS水平，而联用NAC抑制纳他霉素的杀伤作用。<br>　　5.纳他霉素通过抑制AKT/mTOR通路诱导肝癌细胞自噬，且自噬流完整通畅。<br>　　6.纳他霉素与自噬抑制剂CQ或3-MA联合使用，增强纳他霉素的杀伤作用。<br>　　7.在肝癌细胞中过表达PRDX1后，缓解了纳他霉素导致的ROS积累，并减弱其杀伤肿瘤细胞的效果。同时，纳他霉素促进PRDX1泛素化降解。<br>　　8.利用裸鼠皮下移植瘤模型，我们发现50mg/kg纳他霉素能够显著抑制裸鼠皮下瘤生长，且对小鼠主要器官无明显毒副作用。<br>　　研究结论：<br>　　我们发现纳他霉素在体外和体内均通过诱导凋亡表现出抗肝癌活性。从机制上讲，纳他霉素通过泛素化降解PRDX1，导致ROS过度积累，进而促进肿瘤细胞凋亡。在PLC/PRF/5和Huh7两种肝癌细胞中，过表达PRDX1或NAC处理均可缓解纳他霉素诱导的细胞死亡，提示ROS在纳他霉素的抗肿瘤作用中发挥重要作用。同时，我们发现纳他霉素抑制AKT的磷酸化，从而通过AKT/mTOR通路诱导细胞自噬。联用自噬抑制剂氯喹或3-MA可显著增强纳他霉素对肝癌细胞的杀伤作用。此外，我们还发现纳他霉素与肝癌治疗一线药物索拉非尼在抑制肝癌细胞增殖中具有协同作用，可显著提高肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。综上所述，我们的研究为纳他霉素的抗肝癌作用提供了重要的理论基础，同时提出纳他霉素作为一种潜在的抗肿瘤药物单独用于肝癌的治疗，以及与索拉非尼联合用药的抗肝癌治疗策略。