HMGN2对巨噬细胞抗菌功能的影响及其机制研究-论文-万方医学网

HMGN2对巨噬细胞抗菌功能的影响及其机制研究

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摘要目的： 　　探讨HMGN2对巨噬细胞杀菌功能的影响及其分子机制，以及对机体抗微生物感染免疫防御能力的影响。 　　方法： 　　细胞培养及常规处理： 　　常规培养小鼠单核巨噬RAW264.7细胞；常规培养大肠埃希菌标准株19138、尿路致病性大肠埃希菌（Uropathogenic Escherichia coli,UPEC）及肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae,K.p）。 　　脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）及大肠埃希菌标准株19138刺激RAW264.7细胞以检测HMGN2表达变化以及其他各项相关指标。 　　分别使用大肠埃希菌标准株19138、尿路致病性大肠埃希菌（UPEC）及肺炎克雷伯菌（K.p）刺激RAW264.7细胞以检测巨噬细胞的杀菌能力。 　　使用大肠埃希菌标准株19138腹腔注射小鼠，观测小鼠肝脏、脾脏、肺及腹腔内细菌残留情况。 　　分别使用PD98059、SP600125、SB203580、T5224、SN50及BMS-345541等抑制剂处理RAW264.7细胞，然后LPS刺激检测一氧化氮合酶2（NOS2）表达变化。 　　质粒构建（克隆技术）： 　　利用本实验室保藏的Lenti-Crispr-v2质粒，按照说明构建Lenti-Crispr-v2-HMGN2-sgRNA质粒。 　　利用本实验室保藏的PGL3-Basic质粒载体，按照说明构建插入CD14启动子序列的PGL3-CD14-Promoter质粒。 　　转染： 　　利用法国Polyplus公司的jetPRIME?转染试剂，分别向野生型及HMGN2敲除型RAW264.7细胞，转染PGL3-Basic、PGL3-CD14-Promoter质粒，然后在LPS刺激状态下检测CD14启动子的转录效率。 　　利用法国Polyplus公司的jetPRIME?转染试剂，转染lenti-Crispr-v2-HMGN2质粒于RAW264.7细胞以构建HMGN2敲除细胞系。 　　HMGN2敲除细胞系构建： 　　利用Crispr-Cas9技术，按照方法所述步骤构建HMGN2敲除的RAW264.7细胞系，以检测在HMGN2缺失的条件下相应指标变化。 　　利用Crispr-Cas9技术，按照方法所述步骤在HMGN2敲除的RAW264.7细胞基础上构建HMGN2-CD14双敲除RAW264.7细胞株，并在LPS刺激之后检测CD14对巨噬细胞杀菌、NOS2表达及炎症因子变化的影响，以说明CD14在HMGN2介导的巨噬细胞杀菌过程中的作用。 　　巨噬细胞吞噬实验： 　　利用荧光标记的大肠埃希菌生物颗粒进行巨噬细胞吞噬实验，以此来检测在HMGN2敲除之后RAW264.7细胞的吞噬能力变化。 　　巨噬细胞杀菌实验（平板菌落计数法）： 　　采用平板菌落计数法检测在HMGN2敲除后，RAW264.7细胞杀菌能力变化；同时检测在腹腔注射大肠埃希菌标准株19138后，小鼠肝脏、脾脏、肺及腹腔中大肠埃希菌的存活情况。 　　检测在NOS2抑制剂L-NAME作用后，野生型及HMGN2敲除型RAW264.7细胞杀菌能力变化，以研究NOS2在HMGN2介导巨噬细胞杀菌功能中的作用。 　　RT-qPCR法： 　　利用RT-qPCR方法，检测野生型及HMGN2敲除型RAW264.7细胞在LPS刺激后HMGN2（野生型）、CD14、NOS2、COX-2、IL-6、IL-1β、IL-18、IL-10、IL-13、IL-4、IL-12、TNFα、IFNγ、TGFβ，以及趋化因子CCL2、CCL3、CCL7、CCL17、CCL5、CCL22的表达水平，以确定HMGN2对这些基因表达的影响。在HMGN2敲除的同时敲除CD14后，检测NOS2、COX-2、IL-6、IL-1β、TNFα的表达变化，以研究CD14在HMGN2介导的基因表达调控过程的作用。 　　Western Blot法： 　　在LPS刺激（或者不刺激）野生型及HMGN2敲除型RAW264.7细胞后，利用Western Blot方法检测胞内HMGN2、NOS2、CD14表达变化；检测相同条件下ERK、磷酸化ERK、P38、磷酸化P38、JNK、磷酸化JNK的变化，以验证MAPK信号通路在HMGN2调控NOS2表达过程中的作用；检测P65、磷酸化P65、IκBα、磷酸化IκBα表达变化，证明NF-κB信号通路在HMGN2调控NOS2表达过程中的作用；检测组蛋白H3、H3K4me3、H3K9Ac、H3K27Ac、H3K27me3表达变化，研究启动子区组蛋白修饰在HMGN2调控CD14表达过程中的作用。 　　免疫荧光显微镜法： 　　利用免疫荧光法观测LPS刺激之后野生型HMGN2表达变化；并检测HMGN2敲除对RAW264.7细胞吞噬能力的影响。 　　流式细胞术： 　　利用流式细胞术检测野生型及HMGN2敲除型RAW264.7细胞吞噬荧光标记的大肠埃希菌生物颗粒的情况。 　　利用流式细胞术检测小鼠在肺部感染大肠埃希菌状态下巨噬细胞内HMGN2的表达变化； 　　检测野生型及HMGN2敲除型小鼠在受到大肠埃希菌感染时，腹腔冲洗液中巨噬细胞及总细胞数变化。 　　染色质免疫共沉淀法（ChIP）： 　　利用染色质免疫共沉淀方法检测野生型及HMGN2敲除型RAW264.7细胞受到LPS刺激后，在CD14转录调控元件区H3K4me3、H3K9Ac、H3K27Ac、H3K27me3及转录因子CREB的富集情况。 　　双荧光素酶报告基因检测法： 　　利用双荧光素酶报告基因方法，检测LPS刺激后的野生型及HMGN2敲除型RAW264.7细胞内CD14启动子介导的生物荧光素表达变化，说明HMGN2对CD14启动子的调控作用。 　　ELISA： 　　分别使用IL-6、IL-1β、CD14的ELISA试剂盒检测野生型及HMGN2敲除型RAW264.7细胞受到LPS刺激后，细胞培养上清中IL-6、IL-1β、CD14水平变化。同时检测WT及HMGN2敲除小鼠在感染状态下血浆中CD14表达量变化。 　　转录组测序及分析： 　　LPS刺激（及不刺激）野生型及HMGN2敲除型RAW264.7细胞，提取RNA进行Illumina测序，随后进行信息学分析并统计。 　　统计学分析：实验数据均采用SPSS18.0统计软件进行统计分析。 　　结果： 　　1.HMGN2在病原微生物感染巨噬细胞中表达水平下降； 　　2.HMGN2敲除可明显增强巨噬细胞的吞噬和杀菌能力； 　　3.转录组测序分析HMGN2对LPS诱导的RAW264.7细胞基因表达谱的影响； 　　4.HMGN2敲除可通过促进CD14的表达增强巨噬细胞的杀菌能力； 　　5.HMGN2敲除增强CD14启动子区域转录因子及组蛋白H3甲基化及乙酰化修饰物募集； 　　6.HMGN2敲除可能通过促进CD14介导的NO生成增强巨噬细胞的杀菌能力； 　　7.MAPK和NF-κB信号通路参与HMGN2对NO生成的调控； 　　8.HMGN2敲除小鼠较野生型小鼠有更强的细菌清除能力和生存能力； 　　9.HMGN2敲除可促进小鼠体内CD14和NO的生成; 　　10.HMGN2敲除可促进巨噬细胞趋化因子表达及对腹腔巨噬细胞募集； 　　RT-qPCR结果显示在LPS刺激后，HMGN2敲除RAW264.7细胞内趋化因子CCL2、CCL3和CCL7的表达较野生型（WT）细胞明显增多，分别约增加11倍、1.6倍及5.3倍。通过向野生型（WT）和HMGN2敲除小鼠腹腔注射大肠埃希菌标准株19138，构建小鼠腹腔细菌感染模型。12h后，收集腹腔冲洗液，用流式细胞术的方法检测腹腔中募集的巨噬细胞数量。结果显示，与WT相比，HMGN2敲除小鼠腹腔呈现更多的巨噬细胞募集，约增加2倍。 　　11.HMGN2敲除对巨噬细胞的炎症因子也具有调控作用 　　RT-qPCR结果显示，在RAW264.7细胞受LPS刺激后，相较于野生型（WT）细胞，HMGN2敲除细胞中IL-6、IL-1β、COX-2的表达明显降低，分别约下降20倍、2.2倍及3.7倍，但TNFα的表达水平升高，约增加2倍；ELISA结果也表明，在LPS刺激后，HMGN2敲除RAW264.7细胞的培养上清液中检出含量更低的IL-6及IL-1β，约降低4.8倍及2.1倍。 　　在LPS诱导的小鼠败血症模型中，与WT小鼠的肺组织相比，HMGN2敲除小鼠肺组织的炎性损伤及炎性细胞浸润明显更轻。 　　结论： 　　致病菌及其产物感染巨噬细胞，HMGN2表达减少，通过上调启动子区组蛋白H3K4me3、H3K9Ac、H3K27Ac富集水平，促进受体CD14的表达，进而激活MAPK/NF-κB信号通路，诱导巨噬细胞NO以及趋化因子CCL2等的生成和释放，从而增强了巨噬细胞募集和杀菌作用，且HMGN2敲除可减少致炎因子IL-6等的释放，可能对宿主炎性损伤起到一定的保护作用。