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摘要目的：<br>　　随着免疫治疗在肿瘤治疗领域的开拓和发展，越来越多的免疫治疗方式开始用于临床。NK细胞作为固有免疫重要组分，在肿瘤监视、识别、杀伤中起到重要作用。从既往NK细胞的探索性研究来看，供临床使用的NK细胞的来源和数量是长久以来尚未完全解决的问题。我们从健康供者外周血采集血样后体外纯化、分离NK细胞，采用无滋养细胞、无动物血清培养体系，希望通过构建、优化细胞因子组合方案，在GMP生产条件下体外诱导NK细胞扩增。<br>　　异基因造血干细胞移植是治疗恶性血液病的重要方式。然而，移植后肿瘤复发是移植失败的首要原因。移植后免疫重建缓慢，早期移植物抗肿瘤效应不足是移植后肿瘤复发的重要原因之一。我们希望通过移植后早期回输体外扩增的造血干细胞供者来源的NK细胞，弥补移植后早期免疫重建缓慢，达到预防、减少恶性肿瘤复发的目的。<br>　　造血干细胞移植后体内存在复杂的炎性环境，增高的炎性因子，如白细胞介素-15（IL-15）、白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子β（TGF-β），中胚层素（Eomes）等下调NK细胞激活受体如NKG2D，上调抑制性受体如NKG2A、PD-1、CD96等，使NK细胞杀伤功能受损。而决定NK细胞功能的激活性、抑制性受体表达一定程度上受到表观遗传的影响。我们拟在NK细胞扩增体系中加入组蛋白去乙酰化抑制剂西达本胺，观察对NK细胞扩增效率以及功能的影响。同时通过动物实验验证回输NK细胞后继续西达本胺治疗对NK细胞功能的影响。<br>　　材料和方法：<br>　　采集健康志愿者外周血后纯化分离NK细胞用于体外培养。采用含细胞因子无滋养细胞培养基在GMP条件下培养扩增NK细胞。扩增产品通过流式细胞检测扩增细胞纯度，细胞表面激活性受体及抑制性受体表达、TNF-α，γ干扰素，颗粒酶B，穿孔素等NK细胞功能相关细胞因子检测、体外K562杀伤实验等实验评估扩增方案的扩增效率、产品活力和功能。并注射至NCG免疫缺陷鼠评估体内代谢规律。<br>　　选择就诊于四川大学华西医院主院区及上锦院区血液科，符合入排标准拟进行异基因造血干细胞移植的髓细胞白血病患者，选择同期异基因造血干细胞移植后未接受NK细胞输注的髓细胞白血病患者作为对照，在移植后+7、+28天接受供者外周血来源，体外扩增的NK细胞，观察输注后的不良反应及疗效。选择同期接受异基因移植患者作为参照，初步对比评估。<br>　　在标准扩增培养方案上加入西达本胺，观察对NK细胞扩增产量的影响，体外、动物实验评估加用西达本胺的扩增方案对NK细胞功能的影响。<br>　　结果：<br>　　1.通过负向纯化法获得外周血NK细胞纯度达88.3%，进一步因子诱导扩增14天后，NK细胞纯度高达99.8%，平均活力为98.01±1.26%。与基线相比，数量扩增200-1000倍，细胞数可达3-8×109个，可满足临床使用的需要。<br>　　2.扩增后的NK细胞激活性受体如NKG2D、NKp30、NKp46、CD96表达均超过90%，在正对靶细胞特异性抗体IgG介导下能发挥ADCC作用杀伤靶细胞，杀伤实验中以2：1效靶比与K562细胞共培养，对K562细胞杀伤高达84.6%。扩增后CYP荧光染料标记NK细胞注射进入NCG小鼠后，输注后第7天活体成像仍能检测到荧光信号。<br>　　3.明确了培养包被液配方、对激活因子进行了优化，明确了采集外周血时枸橼酸为最优抗凝剂，明确了扩增接种密度为3×106/mL。<br>　　4.临床研究入组患者27例，对照组20例。试验组共扩增完成输注NK细胞43次，其中，16例（59.2%）完成NK细胞输注2次，11例（40.7%）完成NK细胞输注1次。43次输注过程顺利，无明显输注相关发热、皮疹、过敏反应等不适。NK细胞的输注不影响造血重建。同期未输注NK细胞对照相比，急性移植物抗宿主病（aGvHD）发生率有下降趋势，Ⅱ-Ⅳ°，Ⅲ-Ⅳ°aGvHD发生率分别为18.9%和7.1%。CMV病毒激活率仅为23.6%，较对照组显著下降(P=0.0484)。移植后髓细胞白血病累积复发率仅为4.3%，较对照组24.2%明显下降（P=0.0580）。患者2年无白血病生存（LFS）及总生存（OS）率均为84%，较对照组大幅改善。<br>　　5.在现有体外扩增方案基础上加入西达本胺，能够在扩增第14天，NK细胞产量增加31%，体外对K562细胞的杀伤增加22%。急性髓细胞白血病模型小鼠接受扩增NK细胞输注后，西达本胺扩增NK细胞对肿瘤负荷降低较标准方案组为明显，回输后继续给药西达本胺能进一步抑制肿瘤负荷增长。<br>　　结论：<br>　　1．无滋养层细胞，无动物血清的细胞因子体外扩增NK细胞能够获得临床使用剂量的NK细胞，产量及细胞功能能够满足临床使用需求。有较大的临床使用前景。<br>　　2．移植后早期回输供者源体外扩增NK细胞安全有效，能降低高危患者移植后的复发。然而最优剂量、最优输注方案还需进一步探索。<br>　　3．在NK细胞扩增方案中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺能进一步提高NK细胞扩增效率，增强NK细胞杀伤功能，为优化现有扩增方案提供依据。