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摘要研究背景<br>　　模式识别受体（Patternrecognitionreceptors,PRRs）是一类存在于天然免疫细胞中的免疫受体，可以通过识别病原体相关的分子模式（Pathogenassociatedmoleculepatterns,PAMPs）或损伤相关的分子模式（Damageassociatedmolecularpatterns,DAMPs）向下游传递信号，引起炎症反应，启动机体的免疫应答。Toll样受体家族（Toll-likereceptors,TLRs）是广泛研究的一类细胞膜PRR，其中TLR4可以识别革兰氏阴性菌细胞壁成分——脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）。研究证实，LPS通过激活脑内TLR4信号通路，生成大量炎症介质，介导神经炎症的发生。<br>　　α激酶1（Alpha-kinase1,ALPK1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于细胞顶端运输囊泡中，参与细胞骨架、肌凝蛋白的形成和转录等过程。2018年首次报道，ALPK1能够通过识别LPS的合成中间体二磷酸腺苷庚糖（Adenosinediphosphate-Heptose,ADP-Hep），激活下游TIFA-TRAF6-NF-κB信号通路，从而促进炎症的发生。这是一条全新的针对LPS相关分子的模式识别通路，提示ALPK1信号通路可能在神经炎症反应中发挥重要作用。作为一种新型的PRR，ALPK1在大脑的表达情况、以及ADP-Hep/ALPK1信号通路与神经炎症的相关性均未见报道。因此，本文首先检测ALPK1在不同年龄小鼠脑内以及不同脑细胞（神经元、小胶质细胞与星形胶质细胞）中的表达情况；再研究ADP-Hep对小鼠大脑以及小鼠BV2小胶质细胞的ALPK1信号通路及炎症反应的影响；并进一步采用ALPK1基因敲低技术观察BV2细胞中ADP-Hep/ALPK1信号通路及炎症反应的变化。通过上述研究，探索新型PRR——ALPK1在神经炎症中的潜在作用，以期为相关疾病的发病机制及药物开发提供科学依据。<br>　　研究方法<br>　　1．ALPK1在发育及成年小鼠脑内的表达<br>　　（1）实时荧光定量PCR（Quantitativerealtime-PCR,qRT-PCR）检测出生后第1天（Postnatal1day,P1）、第7天（P7）、第21天（P21）、八周龄（8-week-old,W8）的C57BL/6小鼠脑中皮层、纹状体、海马、小脑、脑干的ALPK1mRNA表达水平。以W8小鼠结肠中ALPK1的mRNA表达水平为对照。（2）免疫印迹法（Westernblot）检测P1，P7，P21，W8小鼠脑中ALPK1总蛋白水平。以W8小鼠结肠中ALPK1的蛋白表达水平为对照。（3）免疫荧光染色法检测ALPK1在W8小鼠大脑中的表达分布，以ALPK1在W8小鼠结肠的染色为对照组。（4）免疫荧光染色法检测ALPK1在神经元、小胶质细胞以及星形胶质细胞中的表达。<br>　　2．ADP-Hep激活小鼠大脑ALPK1信号通路及炎症反应<br>　　C57BL/6小鼠大脑右侧脑室注射1mg/kgADP-Hep24h后，（1）酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA）检测大脑匀浆中肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-α,TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）的蛋白表达水平变化；（2）qRT-PCR检测ALPK1mRNA表达水平变化；（3）Westernblot检测ALPK1及下游蛋白肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TNFreceptorassociatedfactor6,TRAF6）、核蛋白核转录因子-κB（Neuronalnucleip65,NF-κBp65）的表达水平变化。<br>　　3．ALPK1信号通路在ADP-Hep刺激的BV2细胞炎症中的作用研究<br>　　ADP-Hep（50、100、200μM）刺激BV2细胞24h后，（1）CCK8检测细胞毒性；（2）qRT-PCR检测炎症因子TNF-α、IL-6及ALPK1的mRNA表达水平；（3）ELISA检测细胞上清液炎症因子TNF-α、IL-6的蛋白表达水平；（4）Westernblot检测ALPK1及TRAF6的表达水平；（5）免疫荧光染色法检测NF-κB的核转情况。<br>　　使用3条ALPK1敲低慢病毒（LV-ALPK1）及对照慢病毒（LV-GFP）感染BV2细胞后，（1）观察不同MOI的感染效率；（2）流式细胞术分选GFP阳性细胞并扩大培养；（3）确定3条LV-ALPK1及LV-GFP感染后的GFP阳性细胞率；（4）Westernblot检测不同慢病毒对BV2细胞ALPK1基因的影响，选择感染后有效突变率最高的细胞进行后续研究；（5）ADP-Hep刺激后，qRT-PCR检测炎症因子TNF-α、IL-6及的mRNA表达水平；（6）ADP-Hep刺激后，ELISA检测细胞上清液炎症因子TNF-α、IL-6的蛋白表达水平；（7）ADP-Hep刺激后，Westernblot检测ALPK1及TRAF6的表达水平；（8）ADP-Hep刺激后，免疫荧光染色法检测NF-κB的核转情况。<br>　　研究结果<br>　　1．ALPK1在发育及成年小鼠脑内的表达<br>　　我们检测到了早在P1发育期小鼠大脑中即存在ALPK1mRNA和蛋白质的表达，ALPK1mRNA水平随年龄波动。在P1小鼠脑内皮层、海马、纹状体、小脑、脑干五个脑区中ALPK1mRNA处于相对较低的水平；在第二至第三周的发育过程中，除皮层以外的其他脑区中ALPK1mRNA表达逐渐增加；而在检测W8小鼠脑内ALPK1mRNA的表达后发现，与第三周相比，五个脑区的ALPK1mRNA表达水平均有所降低，且与W8小鼠结肠相比，W8小鼠脑中五个脑区中的ALPK1mRNA的表达为低水平。而比较同一鼠龄不同脑区组织之间发现，在P1、P21、W8小鼠中，皮层ALPK1mRNA水平均为最低，P1、P7、W8结肠ALPK1mRNA水平均为最高，其余并无明显规律。而在小鼠脑组织总蛋白中，ALPK1蛋白表达水平在小鼠P1时脑内最高，在其发育至第一周时ALPK1蛋白表达水平急剧下降，在第二至第八周发育过程中ALPK1蛋白表达水平逐渐增加。与mRNA水平不同的是，在蛋白水平层面，小鼠脑ALPK1总蛋白比结肠ALPK1总蛋白高但无显著性差异。通过免疫荧光染色法，我们检测了ALPK1蛋白在成年小鼠大脑中的分布，发现ALPK1蛋白在运动皮层及梨状皮层中均有表达。免疫荧光共定位实验结果表明，ALPK1在神经元和小胶质细胞以及星形胶质细胞中均有表达。<br>　　2．ADP-Hep激活小鼠大脑ALPK1信号通路及炎症反应<br>　　侧脑室注射2mg/kgADP-Hep24h后，TNF-α、IL-6的蛋白表达显著增加，qRT-PCR及Westernblot的结果表明，ALPK1的mRNA及蛋白表达水平显著性升高，同时ALPK1下游蛋白TRAF6、核内NF-κBp65表达显著性增加。<br>　　3．ALPK1信号通路在ADP-Hep刺激的BV2细胞炎症中的作用研究<br>　　使用ADP-Hep（50、100、200μM）刺激BV2细胞24h后，其炎症因子TNF-α、IL-6的mRNA水平及蛋白表达水平迅速上升且整体呈剂量相关，但相比ADP-Hep-100μM组，ADP-Hep-200μM组的TNF-α的mRNA水平有稍许下降；qRT-PCR及Westernblot的结果表明，ALPK1的mRNA及蛋白表达水平也随着ADP-Hep剂量增加而显著性升高，但ADP-Hep-200μM组与ADP-Hep-100μM组相比，有稍许下降；除此之外，ALPK1的下游蛋白TRAF6的表达也与ALPK1蛋白表达的趋势一致。NF-κB核转移代表性染色结果表明，ADP-Hep（50、100、200μM）刺激BV2细胞24h后，最终会促使NF-κB发生核转移，且与ADP-Hep剂量呈正相关。根据结果我们选择剂量为100μM的ADP-Hep进行后续实验。<br>　　Westernblot结果显示LV-ALPK1-87能显著降低BV2细胞ALPK1蛋白表达。qRT-PCR和ELISA实验表明，敲低ALPK1基因能够显著降低ADP-Hep刺激BV2细胞引起的THF-α和IL-6表达；Westernblot实验表明，敲低ALPK1基因能够显著降低ADP-Hep刺激BV2细胞引起ALPK1及TRAF6蛋白表达；NF-κB核转移代表性染色结果表明，敲低ALPK1基因能够显著减少ADP-Hep刺激BV2细胞引起NF-κB核转移现象。<br>　　研究结论<br>　　在正常情况下，除P1小鼠脑组织总蛋白水平表达较高，小鼠脑中ALPK1mRNA及蛋白表达整体水平较低。ALPK1在神经元、小胶质细胞以及星形胶质细胞中均有表达。ADP-Hep刺激小鼠大脑后能够激活大脑的炎症反应，并且激活ADP-Hep-ALPK1-TRAF6-NF-κB信号通路。进一步研究发现，ADP-Hep通过激活ALPK1信号通路引起BV2细胞的炎症反应。