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摘要细胞分泌是一项最基本的细胞生命活动，对于维持细胞的正常功能至关重要。细胞受到刺激后，细胞内合成的生物活性物质被膜包裹形成囊泡，囊泡运输到细胞质膜，并与细胞质膜进行融合，将活性分子释放到细胞外。许多细胞活动和生理学过程，例如神经递质释放，胰岛素的分泌，免疫反应和机体的生长发育等，都以细胞分泌过程为基础。细胞分泌离不开膜融合过程，细胞的基本生命活动也依赖膜融合。<br>　　SNARE蛋白是介导膜融合的核心因子，最早发现的SNARE蛋白位于神经元，包含位于突触前膜的syntaxin-1（stx-1）和SNAP-25，以及位于囊泡上的VAMP/synaptobrevin（syb）。syb和stx各有一个跨膜结构域，SNAP-25是无跨膜区的可溶蛋白，其中间区域有四个半胱氨酸，能够被棕榈酰化，使SNAP-25定位到突触前膜。SNARE蛋白在酵母和哺乳动物中高度保守，目前已发现哺乳动物细胞中存在60多个SNARE蛋白家族成员，广泛分布在不同亚细胞区域，如细胞质膜、线粒体、内质网和过氧化物体，能够形成特定的SNARE蛋白复合物，调控不同的膜融合过程。<br>　　SNARE蛋白都含保守的结构域，叫做SNARE结构域，由大约七十个氨基酸组成。一个SNARE复合物包含四个SNARE结构域，形成四个平行的α螺旋束结构，其中syb和stx分别提供一个α螺旋，SNAP-25贡献两个α螺旋。螺旋束就像拉链一样，将突触囊泡膜和突触前膜拉近，促进膜融合的完成，释放神经递质。SNARE蛋白除了组装成正确的SNARE复合物外，在溶液中还会形成一些混乱的复合物，如stx本身能够形成同源二聚体或者四聚体，这种聚集体在生物体内是没有功能的；stx和SNAP-25能够以2:1的比例形成异源二聚体。因此SNARE复合物的正确组装需要调节因子的调控，目前研究最多的调控因子是complexin（Cpx），synaptotagmin-1（syt1），Munc18和Munc13，它们在SNARE组装过程中起抑制和催化双重作用，调控膜融合过程。<br>　　SNARE蛋白对膜融合的调控是细胞生命活动所必须的，因此SNARE蛋白的正常功能对于神经系统，免疫系统的发育至关重要。SNARE蛋白发生突变或者其调控因子功能异常，能够导致抑郁症、智力缺陷、运动障碍和癫痫等，还会造成帕金森综合征、阿尔兹海默症等神经退行性疾病。因此SNARE蛋白的正确组装和对分泌的正常调控对维持机体的生长发育及其重要。<br>　　尽管过去二十多年对SNARE功能及调控机制的研究取得了很大进展，但还有许多分泌调控因子没有被深入研究，如secretagogin（SCGN）蛋白和Doc2（double C2domain protein）蛋白。SCGN是一种EF-hand钙离子感受器蛋白，由六个EF-hand结构域组成，从果蝇到人高度保守。人源的SCGN蛋白主要在胰腺β细胞，大脑的神经系统和肠内分泌细胞高表达。研究发现，SCGN蛋白能够与SNARE蛋白、细胞骨架蛋白以及一些货物蛋白相互作用。最近的研究表明，SCGN在不同的组织和细胞中控制多种荷尔蒙的分泌，如在胰腺β细胞中抑制SCGN的表达，葡萄糖刺激产生的胰岛素分泌明显降低，因此，SCGN敲除小鼠在生命早期就表现出葡萄糖耐受不良，后续逐渐发展为高血糖症。此外，在不同的神经元中，SCGN对促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）和金属蛋白酶2（metalloprotease-2，MMP-2）的分泌至关重要。除了调控细胞分泌过程，SCGN还参与多种细胞进程，包括胰岛素的合成和功能，内质网应激和蛋白质折叠。人体中SCGN功能缺陷与多种疾病的发病机理相关，如神经退行性疾病，自闭症和精神分裂症。最新研究表明，SCGN缺陷导致小鼠更容易患炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）。尽管大量报道表明SCGN具有众多细胞功能和生理学功能，但是SCGN调控细胞分泌的分子机制尚不清楚。<br>　　神经元之间的正常交流依赖对神经递质释放的精确调控。在神经元之间，突触传递的基本方式是动作电位（action potential，AP）诱发的神经递质的释放。诱发释放包括两种形式：一是快速同步的神经递质释放，二是慢速异步的神经递质释放。还有一种突触传递类型是自发神经递质释放，它不依赖动作电位的诱发，参与突触结构和功能的调整（如突触后兴奋，突触后蛋白的合成，树突棘和长期突触可塑性）。<br>　　作为膜融合的关键调控蛋白，SNARE蛋白在三种形式的神经递质释放中都发挥重要功能syt1是一种钙离子感受器蛋白，调控快速的同步神经递质释放过程，Doc2（double C2domain protein）蛋白调控慢速的异步神经递质释放。Doc2蛋白和syt1蛋白都包含两个保守的C2结构域，C2A和C2B，依赖结合钙离子与膜结合。不同的是syt1包含一个跨膜结构域，锚定在突触囊泡膜上，而Doc2蛋白是可溶的胞质蛋白。Doc2蛋白家族主要包括三个成员：Doc2α，Doc2β和Doc2γ。Doc2γ与Doc2α，Doc2β相差甚远，Doc2α和Doc2β序列高度相似，但是二者表达模式不同，Doc2α主要在脑部特异性表达，而Doc2β表达比较广泛。此外，Syt1和Doc2都能够调控自发神经递质的释放。<br>　　研究表明，Doc2α和Doc2β能与SNARE复合物以及SNARE蛋白的调控因子—Munc13和Munc18直接相互作用，促进SNARE复合物的组装，调控细胞的分泌。但是，Doc2蛋白调控分泌和慢速神经递质释放的分子机制目前并不清楚。<br>　　为了探究SCGN对SNARE蛋白的调控作用，我们首先利用生物化学方法在体外验证SCGN与SNARE蛋白的结合情况。发现SCGN依赖钙离子与SNAP-25相互作用，但不与SNARE复合物相互作用。为了确定SNAP-25与SCGN的具体结合片段，我们将SNAP-25进行截短，发现其C端的SNARE结构域是与SCGN结合的关键部位。接下来我们解析了SCGN与SNAP-25-J（143-170aa）小肽在钙离子条件下的晶体结构，每个非对称单元包含两个SCGN和SNAP-25154-170氨基酸序列，12个钙离子。SNAP-25小肽结合在SCGNC端的domainⅢ（包含EF5和EF6），每个SCGN与六个钙离子结合，六个EF-hand中连接E螺旋和F螺旋的loop处是钙离子的结合区域。与单独的SCGN的结构相比，结合了钙离子与SNAP-25的SCGN整体构型依然呈“V”字形，但是构象变化很大，每个结构域都有明显的位移。将两种结构中的domainⅢ进行拟合，发现复合物中SCGN的domainⅠ和domainⅡ相对于domainⅢ位移了180°，钙离子结合区域由β折叠结构变成了没有二级结构的loop（环结构）。这些构象的变化使得SCGN表面暴露出一个疏水槽，容纳SNAP-25小肽形成的α螺旋结构。通过结构分析，我们找到了SCGN与SNAP-25相互作用的关键氨基酸位点并通过GST-pulldown和等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）方法进行了验证，发现SCGN与SNAP-25主要是通过疏水相互作用和氢键结合。将SCGN-SNAP-25-Ca2+复合物与SNARE复合物中的SNAP-25进行结构拟合，发现两种复合物中SNAP-25的构象是一致的。体外脂质体融合实验表明，SCGN与SNAP-25的相互作用，抑制SNARE组装。此外，我们还发现果蝇中唯一的EF-hand蛋白，Cbp53E与SCGN是同源的，能够与SNAP-25相互作用。由于SNAP-23与SNAP-25高度同源，SCGN能够与SNAP-23相互作用，却不能与SNAP-29和SNAP-47相互作用，说明SCGN与SNAP-25相互作用的重要性和保守性。<br>　　由于SCGN对细胞分泌的促进作用，我们推测SCGN不仅仅抑制SNARE复合物的组装。生物化学实验结果表明，SCGN能够依赖钙离子与Doc2α的linker区域（Doc2α-C）特异性结合。序列比对发现Doc2α-C与SNAP-25-J的氨基酸序列高度相似。通过验证，我们发现Doc2α与SNAP-25结合在SCGN的相同区域，Doc2α能够与SNAP-25竞争结合SCGN。脂质体融合实验表明，Doc2α能够解除SCGN对SNARE介导的膜融合的抑制作用，与SCGN共同调控膜融合，进而调控细胞分泌。<br>　　综上所述，我们利用生物化学和结构生物学，通过丰富的体外数据证明了在Doc2α的协助下，SCGN在SNARE介导的膜融合中起到抑制和激活的双重调控作用，解释了SCGN调控细胞分泌的机理。最后提出了新的SCGN和Doc2α共同调控SNARE介导的膜融合的分子机制，为进一步研究SNARE蛋白的调控机制奠定了基础，为神经退行性疾病以及分泌相关疾病的研究提供了新的理论依据。