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摘要噻吩并[2,3-d]嘧啶作为嘌呤生物电子等排体，具有多种药理作用和生物活性，广泛被用于抗癌药物的研究与开发。在mTOR/PI3K、FLT3、EGFR、HER2、VEGFR等多种蛋白激酶抑制剂中，以噻吩并[2,3-d]嘧啶为骨架的靶向小分子也并不少见。鉴于以噻吩并[2,3-d]嘧啶为骨架的靶向药物具有优良的生物活性和独特的抗肿瘤潜力，本人在攻读博士学位期间主要开展了基于噻吩并[2,3-d]嘧啶骨架的①热休克蛋白90（HSP90）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）双靶点抑制剂的设计、合成和抗膀胱癌活性评价，②溴结构域蛋白4（BRD4）抑制剂与一氧化氮（NO）供体杂合体的设计、合成和抗卵巢癌活性评价两个部分的研究。<br>　　第一部分 基于噻吩并[2,3-d]嘧啶骨架的HSP90/mTOR双靶点抑制剂的设计、合成和抗膀胱癌活性评价<br>　　膀胱癌作为泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，随着逐年上升的发病率与死亡率严重危害着人们的健康与生存。膀胱癌组织中过度表达与激活的HSP90和mTOR与肿瘤增殖、转移、侵袭和血管生成密切相关，预示患者的不良预后。该部分研究中，以HSP90和mTOR为研究靶点，通过对现有抑制剂与靶蛋白之间作用模式进行分析和模拟，设计出一系列以噻吩并[2,3-d]嘧啶为基础的HSP90/mTOR双靶点抑制剂。然后分别对HSP90和mTOR抑制剂片段进行合成、拼接，以13～15步化学反应完成3个系列双靶点抑制剂的全合成。<br>　　在构效关系研究中，首先在嘧啶2位和4位引入不同的环状脂肪胺，并证实了嘧啶4位吗啉取代对保持mTOR抑制剂活性的重要性；随后在嘧啶2位引入苯胺活性明显增强的启发下，将氨基转化为不同取代的脲键，得到的系列化合物活性进一步提高。<br>　　在所有化合物中1-(3-氯-4-氟苯基)-3-(4-(7-(2,4-二羟基-5-异丙基苯甲酰基)-4-吗啉-5,6,7,8-四氢吡啶并[4'',3'':4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)脲（24q）对靶蛋白的抑制活性最高，能有效抑制HSP90（IC50=69±8nM）和mTOR（IC50=29±4nM）活性。在体外抗肿瘤活性测试中24q对膀胱癌细胞J82、T24、SW780的IC50值分别为360±30nM、410±60nM和160±30nM，活性优于阳性对照AUY922和AZD8055。为了探讨24q与靶蛋白之间的作用模式，将24q分别对接到HSP90与mTOR的晶体结构中。在与HSP90对接模拟中，24q结构中2,4-二羟基-5-异丙基苯片段占据HSP90N端的ATP结合口袋，位于口袋亲水区的4位羟基与ASN51形成关键氢键，位于口袋疏水区的5位异丙基则伸入由MET98、LEU107、PHE138等残基组成的疏水空腔中，MET98还与苯环形成S-Pi（π）相互作用。除此之外24q分子与HSP90形成的范德华作用和7位羰基与THR184形成的氢键也增强了24q与HSP90的结合。而在与mTOR的对接中，24q结构中酚羟基、脲键羰基和氟原子可分别与GLN2161、ASP2357、GLN2194形成氢键，结构中四氢吡啶并噻吩骨架和氯原子则可与蛋白疏水残基形成疏水相互作用，此外氟原子还可与ASP2191形成卤键。24q与靶蛋白之间的诸多作用保障了分子的活性和选择性。<br>　　随后，通过Annexin V-FITC/PI双染法证实了24q可诱导膀胱癌细胞SW780凋亡，给药浓度为0.2μM和0.5μM时分别使8.1%和14.2%的癌细胞发生凋亡。在24q（0.5μM）处理后的SW780中，透射电镜下可观察到自噬小体形成。Western Blot（WB）实验中，24q处理后的膀胱细胞中HSP90客户蛋白CDK4、C-Raf、CDC2表达明显下降，同时mTOR下游底物p-mTOR（S2448）和p-AKT（S473）的表达也明显下调，再次证明24q可有效抑制HSP90和mTOR。另外，WB实验中自噬相关蛋白中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加和SQSTM-1减少，凋亡相关蛋白细胞色素C和裂解型Caspase-3增加，表明24q可诱导膀胱癌细胞自噬和凋亡。<br>　　在裸鼠移植瘤模型中，24q能明显抑制瘤体增长而对体重无明显影响，TGI高达72.5%，治疗效果优于阳性对照AUY922和AZD8055。最后，肿瘤组织中Ki67、HSP70、p-mTOR、LC3-Ⅱ的免疫组化和TUNEL检测结果显示，24q在体内能通过抑制HSP90和mTOR阻止膀胱癌细胞增殖，诱导细胞凋亡和自噬。<br>　　以上实验结果表明，24q是一种有效HSP90/mTOR双靶点抑制剂，在体内外对膀胱癌展现出良好的抗肿瘤效果，值得进一步研究与开发。<br>　　第二部分 基于噻吩并[2,3-d]嘧啶骨架的BRD4抑制剂/NO供体杂合体的设计、合成和抗卵巢癌活性评价<br>　　卵巢癌作为致死率最高的妇科肿瘤，严重威胁着女性的生命与健康。卵巢癌细胞中BRD4明显扩增和过度表达调控着癌细胞的增殖与发展；低浓度的NO可促进卵巢癌细胞生长，而高浓度的NO则表现出抑瘤作用。因此，该研究部分对BRD4抑制剂/NO供体杂合体进行设计、合成和活性评价，拟开发出一种新型的抗卵巢癌药物。首先，选用课题组前期开发的高效选择性BRD4抑制剂4l作为杂合体的BRD4抑制区域，与硝酸酯类、苯基呋咱氮氧化物类、甲基呋咱氮氧化物类和苯磺酰基呋咱氮氧化物类4种不同类型的NO供体进行杂交，构建出新型的BRD4抑制剂/NO供体杂合体，并进行化学合成和结构表征。<br>　　这4类化合物中苯基呋咱氮氧化物系列对BRD4抑制活性最高，苯磺酰基呋咱氮氧化物系列的体外NO释放量最大，所有化合物中3-((2-(2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-酮-3,4,5,6,7,8-六氢吡啶并[4'',3'':4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯氧基)乙酰氧基)甲基)-4-苯基-1,2,5-恶二唑-2-氧化物（n5）具有最强的BRD4抑制活性（IC50=0.82±0.13μM），且能有效释放NO。n5与BRD4对接结果表明n5可通过氢键、疏水作用与靶蛋白稳定结合，并通过模拟乙酰化的赖氨酸（Kac）有效抑制BRD4对组蛋白的识别。<br>　　随后，经Annexin V-FITC/PI双染法证实了n5可诱导卵巢癌细胞SKOV-3凋亡，孵育24h后1.0μM和2.0μM的n5分别可使10.0%和14.0%的细胞凋亡，具有剂量依赖性。在n5处理后的GFP-LC3转染细胞中可观察到自噬小体形成，同时透射电镜下也观察到明显的自噬特征，提示n5可激活卵巢癌细胞自噬。WB实验中，经n5处理后BRD4和下游蛋白C-Myc表达下调，凋亡抑制蛋白BCL-2减少、细胞色素C和裂解型Caspase-3增多，表明n5可抑制BRD4并诱导肿瘤细胞经线粒体途径凋亡；自噬相关蛋白中LC-Ⅱ/Ⅰ比值增加和Beclin1增多并伴有p62蛋白表达增加，表明经n5处理后，自噬激活时出现自噬流受阻的情况。LC3与LAMP1的免疫荧光染色共定位分析提示n5可抑制自噬小体和溶酶体融合，使肿瘤细胞自噬流受阻。n5在与自噬抑制剂3-MA和Baf-A1联用时，3-MA可逆转n5导致的自噬性死亡，Baf-A1则无明显影响。<br>　　综上，BRD4抑制剂/NO供体杂合体n5在体外可显著抑制BRD4和释放NO，诱导癌细胞经线粒体途径凋亡，在诱导自噬小体生成同时抑制其与溶酶体融合导致肿瘤细胞死亡，具有优良的抗卵巢癌活性，可作为BRD4抑制剂/NO供体杂合体的先导化合物进一步研究。该部分研究结果为靶向抑制剂与NO供体的杂化研究提供了新的思路与方向。