检索历史 清除

摘要背景和目的：<br>　　急性肾损伤（AcuteKidneyInjury,AKI）是由多种因素引起的短时间（几小时至几天）内肾功能急剧恶化而出现的临床综合征，表现为肾小球滤过率降低，血清肌酐、尿素氮潴留，水电解质和酸碱平衡紊乱。AKI具有较高发病率和死亡率，据不完全统计，全球每年约有200万人死于AKI。由于AKI病理生理过程并不完全可逆，部分AKI患者肾功能不能完全恢复，可能发展为不同程度的慢性肾脏病（ChronicKidneyDisease，CKD），严重者最终发展为终末期肾病（Endstagerenaldisease，ESRD），造成严重的社会经济负担。<br>　　临床上AKI的危险因素主要有创伤、手术、脓毒血症、肾毒性药物等，上述因素皆可导致肾脏缺血缺氧，缺血对组织造成损伤也出现在恢复血液灌注后，恢复血液灌注导致组织细胞损伤进一步加重从而引起缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusioninjury，IRI）。IRI打破了细胞还原反应平衡，特别是再灌注过程中代谢产物聚集致使大量活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS），从而触发一系列肾小管细胞事件如线粒体损伤、能量耗竭、凋亡和坏死，加速肾脏损伤。目前临床对于AKI的治疗主要包括肾脏替代治疗（Renalreplacementtherapy，RRT)和营养补充支持，除此之外，尚无有效地减轻AKI肾组织损伤和促进受损组织修复的治疗措施。因此深入研究AKI发病机制，积极寻找新型治疗靶点对AKI治疗有重大意义。<br>　　AKI发病机制复杂，涉及氧化应激、炎症反应和自噬等，其中氧化应激是缺血性AKI的重要原因，IRI后ROS的爆发参与肾脏线粒体失功、能量耗竭、钙离子超载、炎症反应、凋亡和坏死，从而加重肾损伤。线粒体是ROS的主要来源，细胞内约90%的ROS都产生于线粒体，特别是线粒体呼吸链复合体Ⅰ与Ⅲ。线粒体ROS（Mitochondrialreactiveoxygenspecies，mtROS）爆发不仅驱使了急性肾损伤，而且在再灌注后的数天至数月仍引发肾脏病理改变。虽然多种病理机制，如：线粒体脂质和蛋白过氧化；线粒体膜去极化释放细胞色素C激活Caspase依赖的凋亡信号通路；Toll样受体（TLRs）和NLRP3等促炎信号通路激活等，已被报道参与AKI，但氧化应激驱动AKI肾脏线粒体损伤及炎症反应的机制尚不完全清楚。<br>　　线粒体拥有自己的基因组（MitochondrialDNA，mtDNA），其编码了13种呼吸链蛋白，22种转移RNA（tRNA）和2种核糖体RNA（rRNA），因此线粒体功能部分依赖于mtDNA。mtDNA是一种双链环状DNA，由多种蛋白包裹形成一种类似拟核的结构（Nucleoid）。线粒体转录因子A（MitochondrialtranscriptionA，TFAM）是一种首要的包装蛋白，其由细胞核编码合成，然后经HSP60/70复合体转入线粒体发挥功能，而未与mtDNA结合的TFAM会被线粒体基质蛋白酶Lon所降解。TFAM不仅参与维持mtDNA的结构稳态还调控了mtDNA的复制与转录。病理条件（如衰老、应激等）下，TFAM的缺失直接导致mtDNA损耗和线粒体生物合成能力降低。此外，mtDNA损伤也参与调控炎症反应，其从线粒体释放到胞质可激活TLR9、cGAS-STING等信号通路刺激炎症因子分泌。基于以上背景，我们提出AKI后mtROS爆发可能通过扰乱mtDNA结构稳态引发线粒体失功及炎症反应，但其具体机制有待研究。<br>　　本研究采用氧化应激所致肾小管上皮细胞损伤模型和小鼠IRI-AKI模型，评估mtROS对肾脏功能、线粒体功能、炎症反应、mtDNA损伤和TFAM水平等的影响，从而为阐明mtDNA损伤参与IRI-AKI的发病机制和寻找治疗的潜在靶点提供新思路。<br>　　材料和方法：<br>　　1体外实验<br>　　1.1氧化应激对肾小管上皮细胞损伤的影响<br>　　采用缺氧再复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）或叔丁基过氧化氢（t-BHP）建立人肾小管上皮细胞（HK-2）氧化应激模型，并使用线粒体靶向抗氧化剂（Mito-Tempo，MT）降低mtROS水平：CCK8法检测细胞活性；流式细胞术检测mtROS；Mito-Tracker检测线粒体形态；q-PCR检测线粒体相关基因（PGC-1ɑ/ATP5a-1/NDUFS8/UQCRC1）mRNA表达水平；seahorse检测线粒体呼吸功能；RAW264.7细胞趋化实验等探究mtROS在肾小管上皮细胞氧化应激损伤中的作用。<br>　　1.2mtROS对肾小管上皮细胞中tfam转录和降解的作用<br>　　q-PCR和WB检测HK-2细胞中TFAM表达水平；免疫荧光染色分析TFAM与线粒体共定位情况；使用抗氧化剂（MT）、过氧化氢酶（CAT）、NADPH氧化酶1/4（Nox1/4）抑制剂（GKT）、NADPH氧化酶抑制剂（APO）、一氧化氮合酶抑制剂（1400w）干预HK-2细胞，WB检测TFAM和TOM20蛋白表达水平，确认HK-2细胞内ROS来源对TFAM蛋白表达和线粒体质量的影响；LonsiRNA(si-Lon)或蛋白酶抑制剂bortezomib干预HK-2细胞，WB检测Lon和TFAM蛋白表达水平；q-PCR检测mtDNA拷贝数；探究mtROS对tfam转录和降解水平的影响。<br>　　1.3敲低tfam对正常肾小管上皮细胞线粒体功能的影响<br>　　通过tfam干扰RNA（siRNA）敲低HK-2细胞中TFAM表达，TFAM与TOM20免疫荧光分析TFAM蛋白在线粒体的定位情况；流式检测mtROS；seahorse检测线粒体呼吸功能；TFAM与dsDNA免疫荧光分析DNA拟核形态变化；探究TFAM对HK-2细胞线粒体功能的影响。<br>　　1.4mtROS对TFAM介导mtDNA稳态的作用<br>　　在氧化应激条件下使用siRNA敲低HK-2细胞中tfam表达：DCFH-DA荧光探针检测HK-2细胞内ROS产生；WB检测TFAM蛋白表达；TFAM与TOM20免疫荧光分析TFAM蛋白在线粒体的定位情况；seahorse检测线粒体呼吸功能；TFAM与dsDNA免疫荧光分析mtDNA拟核形态变化；q-PCR检测mtDNA拷贝数；Bax/mito/dsDNA荧光染色分析mtDNA逃逸方式；q-PCR检测炎症因子（TNF-ɑ/IL-1β）表达水平；RAW264.7巨噬细胞趋化实验；探究mtROS扰乱mtDNA稳态造成细胞损伤的机制。<br>　　2体内实验<br>　　2.1小鼠肾脏缺血再灌注诱导AKI（IRI-AKI）模型的建立<br>　　雄性C57BL/6小鼠经双侧肾蒂夹闭30min建立缺血再灌注诱导急性肾损伤模型（IRI-AKI），于术后第5天收集小鼠血液和肾脏组织样本，检测肾功能指标如血肌酐（CREA）和血尿素氮（BUN）水平，同时q-PCR检测线粒体相关基因（tfam/PGC-1α/ATP5a1）和炎症因子（ICAM-1/MCP-1）表达，使用DMSO作为溶剂对照组（IRI-AKI+DMSO）；HE染色观察肾脏病理改变，q-PCR检测mtDNA拷贝数。<br>　　2.2mtROS参与IRI-AKI小鼠肾损伤的作用及机制研究<br>　　实验小鼠随机分为三组：正常对照组（CON）、模型组（IRI-AKI）、干预组（IRI-AKI+MT）。干预组小鼠在再灌注成功后给予一次肾原位注射，之后每天腹腔给予5mg/kgMT维持，同时IRI-AKI组给予等量溶剂对照（DMSO）。术后第5天，收集血液检测血肌酐（CREA）和血尿素氮（BUN）；收集肾脏组织：HE染色观察肾脏病理改变；q-PCR检测肾脏炎症因子（IL-6/TNF-α）、线粒体相关基因（tfam/PGC-1α/ATP5a1）、mtDNA拷贝数改变；TUNEL染色检测肾脏细胞凋亡情况；免疫荧光和免疫组化（IHC）检测肾脏损伤分子和炎症因子表达水平；TEM观察肾脏线粒体形态；TFAM与dsDNA免疫荧光双染分析mtDNA形态结构变化；WB检测肾脏组织促凋亡（Bax）及线粒体蛋白（Lon/TFAM/TOM20）表达，从而深入探究mtROS在IRI-AKI小鼠肾脏损伤中的作用。<br>　　3.AKI患者肾脏组织中TFAM蛋白表达检测和mtDNA拟核形态观察<br>　　通过手术获得癌旁和AKI患者肾脏组织，免疫荧光染色确认肾脏组织损伤和线粒体损伤情况；通过TFAM与dsDNA免疫荧光分析mtDNA拟核形态变化。<br>　　4.间充质干细胞来源细胞外囊泡（MSC-EV）干预氧化应激所致mtDNA损伤作用初探<br>　　4.1MSC-EV的提取和鉴定<br>　　人脐带间充质干细胞（hMSCs）由四川省干细胞库分离和鉴定，使用含有10%去除EV血清的DMEM培养基培养，并分为三组：正常对照组（NC）、tfamsiRNA处理组（TFAM-KD）、H2O2处理组（Aged）收集上清经经初离（300g，10min；2,000g，15min；10,000g，30min）和超高速离心（100,000g，1.5h）超高速离心获得MSC-EV；WB检测MSC-EV表面标志物；NTA检测MSC-EV大小和颗粒数；TEM观察MSC-EV形态。PKH26和RNASelect探针标记MSC-EV以观察HK-2细胞对其摄取。<br>　　4.2MSC-EV中TFAM和线粒体组分检测<br>　　取经过超高速离心得到的MSC-EV，提取RNA和DNA，q-PCR检测tfammRNA表达和mtDNA拷贝数；普通PCR（RT-PCR）扩增mtDNA片段，琼脂糖凝胶电泳检测mtDNA长片段。<br>　　4.3MSC-EV干预对肾小管上皮细胞中TFAM蛋白表达和mtDNA拷贝数的作用<br>　　使用H2O2建立HK-2细胞氧化应激模型，并使用不同剂量MSC-EV干预：q-PCR检测mtDNA拷贝数；WB检测TFAM与TOM20蛋白表达水平；使用蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide，CHX）或tfamsiRNA处理HK-2细胞再给予MSCEV干预，WB检测TFAM和TOM20蛋白表达水平；探索MSC-EV是否通过TFAM信号通路发挥作用。<br>　　4.4MSC-EV干预对肾小管上皮细胞mtDNA稳态和线粒体功能的作用<br>　　TFAM与TOM20免疫荧光分析TFAM蛋白在线粒体的定位；TOM20与dsDNA免疫荧光分析mtDNA拟核形态变化；seahorse检测线粒体呼吸功能。<br>　　结果：<br>　　1.体外实验<br>　　1.1氧化应激诱导肾小管上皮细胞线粒体功能障碍和炎症因子释放<br>　　t-BHP或H/R诱导HK-2细胞氧化应激损伤，结果显示HK-2细胞内ROS和mtROS水平升高、细胞活力下降、线粒体片段化增加、线粒体呼吸功能降低、线粒体相关基因（PGC-1ɑ/ATP5a-1/NDUFS8/UQCRC1）mRNA表达降低、促炎相关基因（TNF-ɑ/IL-1β）mRNA表达水平升高及RAW264.7巨噬细胞迁移数量增加。使用MT降低mtROS水平后，HK-2细胞氧化应激所致线粒体功能紊乱得到显著恢复，炎症因子表达和巨噬细胞趋化水平显著降低，表明mtROS参与氧化应激所致肾小管线粒体损伤和炎症反应过程。<br>　　1.2mtROS扰乱TFAM转录和降解参与肾小管上皮细胞氧化应激损伤<br>　　与CON组相比，t-BHP致使HK-2细胞中TFAM基因和蛋白表达水平降低，而降低mtROS水平后，tfammRNA和蛋白表达水平得到恢复。进一步使用多种ROS抑制剂发现mtROS是导致HK-2细胞中TFAM蛋白表达下降的主要因素。使用bortezomib抑制Lon活性或siRNA敲低Lon表达，正常培养条件下，HK-2细胞中TFAM蛋白表达水平有所增加，表明抑制Lon介导的TFAM降解可增加HK-2细胞内TFAM蛋白含量。即使是在使用siRNA敲低tfam表达的情况下，使用bortezomib干预后，TFAM的蛋白水平也会有所提升。此外，t-BHP或H/R诱导HK-2细胞氧化应激中，bortezomib和LonsiRNA干预均可增加TFAM蛋白含量和mtDNA拷贝数，且这种效应与降低mtROS产生的效应一致，以上结果说明过量mtROS的产生降低tfam基因转录并增加了Lon介导的TFAM蛋白降解。<br>　　1.3敲低TFAM造成正常培养肾小管上皮细胞线粒体功能损伤<br>　　采用tfamsiRNA处理正常HK-2细胞后，tfammRNA和蛋白表达水平显著降低；TFAM与TOM20共染发现线粒体部位TFAM的蛋白水平降低；TFAM的降低导致HK-2细胞mtROS些许升高，线粒体呼吸功能受阻以及胞浆mtDNA的泄露增加，表明TFAM缺失即可导致HK-2细胞线粒体功能受损。<br>　　1.4mtROS扰乱TFAM介导mtDNA稳态参与肾小管上皮细胞损伤<br>　　t-BHP或H/R处理后，HK-2细胞中mtDNA异常聚集，裸露mtDNA增加，且mtDNA拷贝数降低。降低mtROS水平减轻mtDNA损伤，然而这种保护作用被tfamsiRNA所削弱。进一步研究发现，未与线粒体共定位的mtDNA能通过Bax蛋白孔道通道逃逸。此外H/R诱导黏附因子（ICAM-1）和促凋亡因子（BAX）蛋白表达水平升高，降低mtROS水平减少炎症因子和Bax蛋白表达，然而这样的效应被tfamsiRNA所削弱，表明mtROS可能通过扰乱TFAM介导的mtDNA稳态参与HK-2细胞氧化应激所致线粒体损伤和炎症反应。<br>　　2体内实验<br>　　2.1小鼠肾脏缺血再灌注诱导AKI(IRI-AKI)模型的建立<br>　　IRI术后第5天，与CON组相比，IRI-AKI组和IRI-AKI+DMSO组血清CREA和BUN水平显著升高，病理检查发现肾小管坏死、扩张、管型形成且炎症因子（ICAM-1/MCP-1）和促凋亡（Bax）mRNA表达水平升高、线粒体相关基因（tfam/PGC-1α/ATP5a1）mRNA表达降低、mtDNA拷贝数降低。<br>　　2.2mtROS参与IRI-AKI发生发展<br>　　2.2.1mtROS促进IRI-AKI肾脏损伤和炎症反应<br>　　与CON组相比，IRI-AKI组CREA、BUN、肾小管坏死数量、肾脏损伤分子（Kim-1）及肾小管凋亡数量显著增加，此外炎症因子（IL-6/TNF-α）、趋化因子基因（MCP-1）mRNA表达和CD68+巨噬细胞数量也显著增加，而降低mtROS水平，肾脏功能、凋亡和炎症反应指标得到显著改善，表明mtROS是参与IRI-AKI的重要病理因素。<br>　　2.2.2mtROS诱导IRI-AKI肾脏线粒体损伤<br>　　与CON组相比，IRI-AKI组肾脏mtROS升高、DNA损伤标志8-OHdG表达也显著增加，说明即使是在缺血再灌注的几天后，mtROS持续产生且参与肾脏的组织病理改变。此外IRI-AKI造成肾脏线粒体数量减少、片段化增加、形态肿胀、ATP水平和mtDNA拷贝数降低，而降低mtROS水平后，上述损伤得到部分缓解，说明IRI-AKI过程中，mtROS可能通过参与了线粒体损伤的发生，特别是线粒体形态改变和mtDNA损伤进而加速肾脏组织病理改变。<br>　　2.2.3mtROS诱导IRI-AKI肾脏TFAM降低和mtDNA损伤<br>　　与CON组相比，IRI-AKI组肾脏tfammRNA和蛋白表达水平降低，而降低mtROS部分恢复tfammRNA和蛋白表达水平。与体外细胞实验结果一致，IRI-AKI组肾脏组织中BAX基因和蛋白表达升高、mtDNA聚集、裸露mtDNA增加，而降低mtROS水平可有效缓解IRI-AKI小鼠肾脏mtDNA损伤和Bax表达。<br>　　3AKI患者肾脏组织中存在TFAM表达降低和mtDNA损伤<br>　　与Control组相比，AKI患者肾脏组织中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）表达升高，TOM20和TFAM蛋白表达降低。此外AKI患者肾脏组织中mtDNA聚集，裸露mtDNA比例增加。<br>　　4MSC-EV通过维持mtDNA稳态改善肾小管上皮细胞损伤初探<br>　　4.1MSC-EV的提取和鉴定<br>　　TEM观察发现MSC-EV呈圆形、椭圆形囊泡状，大小在50-500nm左右，且表达EV阳性标志物ALIX、TSG101和HSP70，不表达阴性标志物GM130。此外，PKH26和RNASelect标记的MSC-EV均能够被HK-2细胞所摄取。<br>　　4.2MSC-EV中含有tfammRNA和线粒体组分<br>　　MSC-EV检测到tfammRNA和线粒体蛋白（如：COXIV、TOM20和ATP5a1），但未检测到TFAM蛋白；此外EV中含有mtDNA片段和mtDNA拷贝数；HK-2细胞中观察到PKH26标记的MSC-EV与线粒体共定位。<br>　　4.3MSC-EV恢复受损肾小管上皮细胞中TFAM蛋白表达和mtDNA拷贝数<br>　　MSC-EV恢复TFAM、TOM20蛋白表达水平和mtDNA拷贝数且较高浓的MSC-EV干预效果更佳。蛋白合成抑制剂CHX或tfamsiRNA处理HK-2细胞后MSC-EV对TFAM蛋白和mtDNA拷贝数的作用被消弱。上结果表明，MSC-EV可能通过TFAM信号发挥作用。<br>　　4.4MSC-EV改善受损肾小管上皮细胞线粒体功能及降低炎症因子表达<br>　　MSC-EV降低H2O2诱导的HK-2细胞线粒体片段化、线粒体功能障碍和mtDNA形态异常和泄露。此外，MSC-EV降低LPS诱导原代肾小管细胞炎症因子（HMGB1/IL-6）蛋白表达水平，但敲低tfam（TFAM-KD）和氧化应激诱导衰老（Aged）来源MSC-EV对其作用削弱。<br>　　结论：<br>　　本研究表明mtROS是导致AKI后线粒体损伤和炎症反应的重要分子，mtROS可通过抑制TFAM的转录和增加其降解导致肾脏TFAM蛋白缺失。而TFAM蛋白的缺失会导致mtDNA拟核稳定性和线粒体功能力降低，最终导致线粒体片段化、胞浆mtDNA增加和炎症因子释放，加速AKI进程。因此mtROS所致mtDNA稳态失衡在AKI中具有重要作用，而TFAM为缺血性AKI治疗提供了一个潜在靶点。此外MSC-EV可降低肾小管上皮细胞中TFAM和mtDNA损伤，改善线粒体功能，从而减轻肾小管细胞氧化应激损伤。