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环状RNA调控Nrf2信号通路在PM2.5致HUVEC细胞氧化应激中的作用

摘要目的<br>  细颗粒物(PM2.5)是重要的生产性毒物和大气污染物。虽然PM2.5进入人体的主要途径是通过呼吸系统,但PM2.5暴露的最大风险是发展为心血管疾病。大量国内外研究表明,氧化应激是PM2.5诱发心血管疾病的重要病理学基础,核因子E2相关因子2(Nrf2)被认为在细胞抗氧化防御机制方面发挥着关键作用。近年来,随着高通量测序技术的发展,大量非编码RNA,如环状RNA因被发现具备调控心血管疾病的功能而日益得到认可。目前,对于在PM2.5诱发的心血管疾病的机制中,关于circRNA的研究还不够充足,为了充分发挥circRNA在未来诊断生物学标志物和治疗、干预的理想靶标作用,本研究将探讨PM2.5的毒作用对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞氧化应激、Nrf2信号通路、circRNA表达谱的影响,并探索circRNA在PM2.5致HUVEC细胞氧化应激及Nrf2信号通路中的作用,以丰富PM2.5的毒作用机制,为预防和治疗PM2.5引起的心血管疾病提供科学依据。<br>  方法<br>  1.采集大气中的PM2.5,制备成PM2.5母液用于配制不同浓度的染毒液;取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行体外实验;CCK-8法检测0、25、50、75、100、150、200μg/mLPM2.5染毒液处理24h和48h的HUVEC细胞存活率;取0、25、50、75μg/mLPM2.5染毒液处理HUVEC细胞24h,WST-8法、NADPH法和TAB法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力和丙二醛(MDA)含量;RT-qPCR法和WesternBlot法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)的mRNA和蛋白表达水平;取0、75μg/mLPM2.5染毒液处理HUVEC细胞24h,circRNA测序和生物信息学分析技术筛选与氧化应激和Nrf2信号通路相关的差异circRNA,RT-qPCR实验加以验证。<br>  2.RNaseR消化实验验证hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960的环状结构;利用细胞转染技术和RNA干扰技术敲低HUVEC细胞中hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960水平,RT-qPCR法确定最佳干扰序列siRNA;敲低hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960后暴露75μg/mLPM2.524h,检测HUVEC细胞中SOD、GPX活力和MDA含量及Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA和蛋白表达水平。<br>  结果<br>  1.PM2.5暴露对HUVEC细胞存活率、氧化应激水平、Nrf2信号通路表达及circRNA表达谱的影响<br>  1.1细胞存活率:随PM2.5染毒浓度升高,HUVEC细胞存活率下降,染毒24h的细胞半数抑制效应浓度(IC50)处于100~150μg/mL之间,染毒48h的IC50处于75~100μg/mL之间。<br>  1.2氧化应激水平:25、50、75μg/mLPM2.5染毒组SOD活力显著下降(均P<0.05);75μg/mL染毒组GPX活力显著下降(P<0.05);50、75μg/mL染毒组MDA含量显著升高(均P<0.05)。<br>  1.3Nrf2信号通路表达:50和75μg/mLPM2.5染毒组Nrf2的mRNA和蛋白的表达水平显著升高(均P<0.05);50和75μg/mL染毒组HO-1的mRNA的表达水平显著升高(均P<0.05);25、50和75μg/mL染毒组HO-1的蛋白表达水平显著升高(均P<0.05),;25、50和75μg/mL染毒组NQO1的mRNA和蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。<br>  1.4circRNA表达谱及circRNA筛选、验证:在0和75μg/mLPM2.5染毒组中,差异表达的circRNA中有7210个上调(差异倍数≥2,q值≤0.001),6936下调(差异倍数≤-2,q值≤0.001);筛选出5条上调circRNA:hsa_circ_0004983、hsa_circ_0018982、hsa_circ_0023249、hsa_circ_0000199和hsa_circ_0087960与抗氧化活性和Nrf2信号通路存在联系。RT-qPCR法验证测序结果显示,与对照组相比,染毒组HUVEC细胞内5条circRNA的转录水平均升高,变化趋势与测序结果一致。当PM2.5浓度≥25μg/mL时,hsa_circ_0004983、hsa_circ_0087960和hsa_circ_0000199的表达水平均明显升高(均P<0.05);相关性分析结果显示,hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960与PM2.5浓度的相关系数较大(r=0.988、r=0.947,P<0.05)。<br>  2.敲低hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960对PM2.5诱导HUVEC细胞氧化应激和Nrf2信号通路表达的影响<br>  2.1环状结构验证:RNaseR消化实验结果显示,hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960不易被RNaseR消化(均P>0.05)。<br>  2.2hsa_circ_0004983对氧化应激水平的影响:<br>  与阴性转染组(NC组)相比,阳性转染组(siRNA1组)的SOD和GPX活力明显升高,MDA含量明显降低(均P<0.05),NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显降低,MDA含量明显升高(均P<0.05);与siRNA1+PM2.5组相比,siRNA1组的SOD和GPX活力明显更高,MDA含量更低(均P<0.05),NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显更低,MDA含量明显更高(均P<0.05);siRNA1+PM2.5组的SOD和GPX活力,以及MDA含量与NC组比,差异无统计学意义(均P>0.05);与siRNA1组相比,NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显更低,MDA含量更高(均P<0.05)。<br>  2.3hsa_circ_0004983对Nrf2信号通路的影响:<br>  与NC组相比,siRNA1组Nrf2的mRNA和蛋白表达水平没有显著变化(均P>0.05),PM2.5处理组(NC+PM2.5组和siRNA1+PM2.5组)Nrf2的mRNA及蛋白表达水平均显著升高(均P<0.05),且siRNA1+PM2.5组Nrf2的mRNA表达水平显著高于siRNA1组(P<0.05)。<br>  与NC组相比,siRNA1组和PM2.5处理组(NC+PM2.5组和siRNA1+PM2.5组)HO-1的mRNA和蛋白水平明显升高(均P<0.05)。与siRNA1+PM2.5组相比,siRNA1组和NC+PM2.5组HO-1的mRNA和蛋白水平明显更低(均P<0.05);与siRNA1组相比,NC+PM2.5组HO-1的mRNA水平明显更低(均P<0.05)。<br>  与NC组相比,siRNA1组NQO1的mRNA水平降低(P>0.05),蛋白水平明显升高(P<0.05);PM2.5处理组(NC+PM2.5组和siRNA1+PM2.5组)NQO1的mRNA和蛋白水平均明显升高(均P<0.05);与siRNA1+PM2.5组相比,siRNA1组NQO1的mRNA和蛋白水平、NC+PM2.5组NQO1的蛋白水平明显更低(均P<0.05);与siRNA1组相比,NC+PM2.5组NQO1的mRNA水平明显更高(P<0.05)。<br>  2.4hsa_circ_0087960对氧化应激水平的影响:<br>  与NC组相比,siRNA2组的SOD和GPX活力明显升高,MDA含量明显降低(均P<0.05),NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显降低,MDA含量明显升高(均P<0.05),siRNA2+PM2.5组的SOD和GPX活力稍高,MDA含量稍低(均P>0.05);与siRNA2+PM2.5相比,siRNA2组的SOD和GPX活力更高,MDA含量更低(GPX活力:P>0.05,SOD活力和MDA含量均P<0.05),NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显更低,MDA含量明显更高(均P<0.05);与siRNA2组相比,NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显更低,MDA含量更高(均P<0.05)。<br>  2.5hsa_circ_0087960对Nrf2信号通路的影响:<br>  与NC组相比,siRNA2组的Nrf2的mRNA表达水平无明显变化(P>0.05),而HO-1和NQO1的mRNA表达水平明显上升(均P<0.05),PM2.5处理组(NC+PM2.5组和siRNA2+PM2.5组)的Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA水平均明显升高(均P<0.05);与siRNA2+PM2.5组相比,siRNA2组和NC+PM2.5组的Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA表达水平明显更低(均P<0.05);与siRNA2组相比,NC+PM2.5组Nrf2的mRNA表达水平明显更高(均P<0.05),HO-1的mRNA表达水平明显更低(均P<0.05)。<br>  与NC组相比,siRNA2组的Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平无明显上升(均P>0.05),PM2.5处理组(NC+PM2.5组和siRNA2+PM2.5组)的Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平明显升高(均P<0.05);与siRNA2+PM2.5组相比,siRNA2组的Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平明显更低(均P<0.05),NC+PM2.5组的稍高(均P>0.05)。<br>  结论<br>  1.PM2.5可抑制HUVEC细胞活性、诱发氧化应激、激活Nrf2信号通路、改变circRNA表达谱的影响<br>  2.hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960低表达通过促进Nrf2信号通路及其下游HO-1和NQO1的表达抑制PM2.5暴露所致HUVEC细胞氧化应激<br>  3.hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960发挥促进氧化应激作用,具有成为预防和治疗心血管疾病新靶点的潜力。

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学位信息:
广东药科大学 公共卫生与预防医学 公共卫生(硕士) 2022年
分类号 R122
发布时间 2023-03-29
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