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摘要目的<br>　　细颗粒物（PM2.5）是重要的生产性毒物和大气污染物。虽然PM2.5进入人体的主要途径是通过呼吸系统，但PM2.5暴露的最大风险是发展为心血管疾病。大量国内外研究表明，氧化应激是PM2.5诱发心血管疾病的重要病理学基础，核因子E2相关因子2（Nrf2）被认为在细胞抗氧化防御机制方面发挥着关键作用。近年来，随着高通量测序技术的发展，大量非编码RNA，如环状RNA因被发现具备调控心血管疾病的功能而日益得到认可。目前，对于在PM2.5诱发的心血管疾病的机制中，关于circRNA的研究还不够充足，为了充分发挥circRNA在未来诊断生物学标志物和治疗、干预的理想靶标作用，本研究将探讨PM2.5的毒作用对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞氧化应激、Nrf2信号通路、circRNA表达谱的影响，并探索circRNA在PM2.5致HUVEC细胞氧化应激及Nrf2信号通路中的作用，以丰富PM2.5的毒作用机制，为预防和治疗PM2.5引起的心血管疾病提供科学依据。<br>　　方法<br>　　1.采集大气中的PM2.5，制备成PM2.5母液用于配制不同浓度的染毒液；取人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行体外实验；CCK-8法检测0、25、50、75、100、150、200μg/mLPM2.5染毒液处理24h和48h的HUVEC细胞存活率；取0、25、50、75μg/mLPM2.5染毒液处理HUVEC细胞24h，WST-8法、NADPH法和TAB法检测超氧化物歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活力和丙二醛（MDA）含量；RT-qPCR法和WesternBlot法检测核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）、醌氧化还原酶1（NQO1）的mRNA和蛋白表达水平；取0、75μg/mLPM2.5染毒液处理HUVEC细胞24h，circRNA测序和生物信息学分析技术筛选与氧化应激和Nrf2信号通路相关的差异circRNA，RT-qPCR实验加以验证。<br>　　2.RNaseR消化实验验证hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960的环状结构；利用细胞转染技术和RNA干扰技术敲低HUVEC细胞中hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960水平，RT-qPCR法确定最佳干扰序列siRNA；敲低hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960后暴露75μg/mLPM2.524h，检测HUVEC细胞中SOD、GPX活力和MDA含量及Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA和蛋白表达水平。<br>　　结果<br>　　1.PM2.5暴露对HUVEC细胞存活率、氧化应激水平、Nrf2信号通路表达及circRNA表达谱的影响<br>　　1.1细胞存活率：随PM2.5染毒浓度升高，HUVEC细胞存活率下降，染毒24h的细胞半数抑制效应浓度（IC50）处于100~150μg/mL之间，染毒48h的IC50处于75~100μg/mL之间。<br>　　1.2氧化应激水平：25、50、75μg/mLPM2.5染毒组SOD活力显著下降（均P＜0.05）；75μg/mL染毒组GPX活力显著下降（P＜0.05）；50、75μg/mL染毒组MDA含量显著升高（均P＜0.05）。<br>　　1.3Nrf2信号通路表达：50和75μg/mLPM2.5染毒组Nrf2的mRNA和蛋白的表达水平显著升高（均P＜0.05）；50和75μg/mL染毒组HO-1的mRNA的表达水平显著升高（均P＜0.05）；25、50和75μg/mL染毒组HO-1的蛋白表达水平显著升高（均P＜0.05），；25、50和75μg/mL染毒组NQO1的mRNA和蛋白表达水平显著升高（均P＜0.05）。<br>　　1.4circRNA表达谱及circRNA筛选、验证：在0和75μg/mLPM2.5染毒组中，差异表达的circRNA中有7210个上调（差异倍数≥2，q值≤0.001），6936下调（差异倍数≤-2，q值≤0.001）；筛选出5条上调circRNA：hsa_circ_0004983、hsa_circ_0018982、hsa_circ_0023249、hsa_circ_0000199和hsa_circ_0087960与抗氧化活性和Nrf2信号通路存在联系。RT-qPCR法验证测序结果显示，与对照组相比，染毒组HUVEC细胞内5条circRNA的转录水平均升高，变化趋势与测序结果一致。当PM2.5浓度≥25μg/mL时，hsa_circ_0004983、hsa_circ_0087960和hsa_circ_0000199的表达水平均明显升高（均P＜0.05）；相关性分析结果显示，hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960与PM2.5浓度的相关系数较大（r=0.988、r=0.947，P＜0.05）。<br>　　2.敲低hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960对PM2.5诱导HUVEC细胞氧化应激和Nrf2信号通路表达的影响<br>　　2.1环状结构验证：RNaseR消化实验结果显示，hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960不易被RNaseR消化（均P＞0.05）。<br>　　2.2hsa_circ_0004983对氧化应激水平的影响：<br>　　与阴性转染组（NC组）相比，阳性转染组（siRNA1组）的SOD和GPX活力明显升高，MDA含量明显降低（均P＜0.05），NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显降低，MDA含量明显升高（均P＜0.05）；与siRNA1+PM2.5组相比，siRNA1组的SOD和GPX活力明显更高，MDA含量更低（均P＜0.05），NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显更低，MDA含量明显更高（均P＜0.05）;siRNA1+PM2.5组的SOD和GPX活力，以及MDA含量与NC组比，差异无统计学意义（均P＞0.05）;与siRNA1组相比，NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显更低，MDA含量更高（均P＜0.05）。<br>　　2.3hsa_circ_0004983对Nrf2信号通路的影响：<br>　　与NC组相比，siRNA1组Nrf2的mRNA和蛋白表达水平没有显著变化（均P＞0.05），PM2.5处理组（NC+PM2.5组和siRNA1+PM2.5组）Nrf2的mRNA及蛋白表达水平均显著升高（均P＜0.05），且siRNA1+PM2.5组Nrf2的mRNA表达水平显著高于siRNA1组（P＜0.05）。<br>　　与NC组相比，siRNA1组和PM2.5处理组（NC+PM2.5组和siRNA1+PM2.5组）HO-1的mRNA和蛋白水平明显升高（均P＜0.05）。与siRNA1+PM2.5组相比，siRNA1组和NC+PM2.5组HO-1的mRNA和蛋白水平明显更低（均P＜0.05）；与siRNA1组相比，NC+PM2.5组HO-1的mRNA水平明显更低（均P＜0.05）。<br>　　与NC组相比，siRNA1组NQO1的mRNA水平降低（P＞0.05），蛋白水平明显升高（P＜0.05）；PM2.5处理组（NC+PM2.5组和siRNA1+PM2.5组）NQO1的mRNA和蛋白水平均明显升高（均P＜0.05）；与siRNA1+PM2.5组相比，siRNA1组NQO1的mRNA和蛋白水平、NC+PM2.5组NQO1的蛋白水平明显更低（均P＜0.05）；与siRNA1组相比，NC+PM2.5组NQO1的mRNA水平明显更高（P＜0.05）。<br>　　2.4hsa_circ_0087960对氧化应激水平的影响：<br>　　与NC组相比，siRNA2组的SOD和GPX活力明显升高，MDA含量明显降低（均P＜0.05），NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显降低，MDA含量明显升高（均P＜0.05），siRNA2+PM2.5组的SOD和GPX活力稍高，MDA含量稍低（均P＞0.05）；与siRNA2+PM2.5相比，siRNA2组的SOD和GPX活力更高，MDA含量更低（GPX活力：P＞0.05，SOD活力和MDA含量均P＜0.05），NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显更低，MDA含量明显更高（均P＜0.05）；与siRNA2组相比，NC+PM2.5组的SOD和GPX活力明显更低，MDA含量更高（均P＜0.05）。<br>　　2.5hsa_circ_0087960对Nrf2信号通路的影响：<br>　　与NC组相比，siRNA2组的Nrf2的mRNA表达水平无明显变化（P＞0.05），而HO-1和NQO1的mRNA表达水平明显上升（均P＜0.05），PM2.5处理组（NC+PM2.5组和siRNA2+PM2.5组）的Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA水平均明显升高（均P＜0.05）；与siRNA2+PM2.5组相比，siRNA2组和NC+PM2.5组的Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA表达水平明显更低（均P＜0.05）；与siRNA2组相比，NC+PM2.5组Nrf2的mRNA表达水平明显更高（均P＜0.05），HO-1的mRNA表达水平明显更低（均P＜0.05）。<br>　　与NC组相比，siRNA2组的Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平无明显上升（均P＞0.05），PM2.5处理组（NC+PM2.5组和siRNA2+PM2.5组）的Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平明显升高（均P＜0.05）；与siRNA2+PM2.5组相比，siRNA2组的Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平明显更低（均P＜0.05），NC+PM2.5组的稍高（均P＞0.05）。<br>　　结论<br>　　1.PM2.5可抑制HUVEC细胞活性、诱发氧化应激、激活Nrf2信号通路、改变circRNA表达谱的影响<br>　　2.hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960低表达通过促进Nrf2信号通路及其下游HO-1和NQO1的表达抑制PM2.5暴露所致HUVEC细胞氧化应激<br>　　3.hsa_circ_0004983和hsa_circ_0087960发挥促进氧化应激作用，具有成为预防和治疗心血管疾病新靶点的潜力。