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摘要研究背景：<br>　　糖尿病患病率高、危害大，而肝脏作为人体糖代谢的重要器官，在糖尿病进程中最易受损。NAFLD是T2DM相关性肝病最常见的类型，超过70%的T2DM患者患有NAFLD，严重危害人民生命健康。该疾病伴随着严重的胰岛素抵抗，肝细胞脂肪变性和脂质蓄积，其病因病机复杂，目前临床上难以治愈。NAFLD和T2DM互相影响，导致肝病迅速发展、内分泌代谢紊乱加重。目前对于T2DM合并NAFLD的发病机制尚未阐明，也尚无针对该疾病治疗的有效药物，因此研究T2DM合并NAFLD的发病进展，探索有效防治药物具有重要意义。田黄方是由郭姣教授自主创制的防治糖脂代谢性疾病方药，本课题前期研究发现田黄方可以降低血脂和调节血糖，但其对T2DM合并NAFLD是否有作用及作用机制有待进一步阐明。<br>　　研究目的：<br>　　通过网络药理学和动物实验探讨田黄方调节T2DM合并NAFLD小鼠糖脂代谢紊乱的药效作用和分子机制，为T2DM合并NAFLD疾病新靶点的发现及药物开发奠定基础。<br>　　研究方法：<br>　　1.考察田黄方对T2DM合并NAFLD小鼠糖脂代谢紊乱的调节作用。<br>　　采用高脂饮食联合腹腔注射小剂量STZ诱导建立T2DM合并NAFLD小鼠模型。实验设置空白组、模型组、田黄方高剂量、田黄方低剂量组和阳性药组，考察田黄方对小鼠体重、肝脏指数、葡萄糖耐量、空腹血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、血脂相关指标、肝损伤指标，血清脂联素等的影响，同时观察肝脏和胰腺组织的病理变化。<br>　　2.通过网络药理学预测田黄方调节T2DM合并NAFLD小鼠糖脂代谢紊乱的可能作用机制。<br>　　依据TCMSP数据库、PubChem数据库以及SwissTargetPrediction数据库筛选田黄方的有效成分，并预测及统计各个成分可能作用靶点，借助Cytoscape3.9.1软件绘制“田黄方-化学成分-靶点”网络。在GeneCard数据库网页筛选疾病靶点之后，利用微生信平台做出田黄方活性成分作用靶点和疾病靶点的Venn图，得到潜在靶点，构建“田黄方-活性成分-潜在靶点”网络。将潜在靶点输入到STING数据库，构建PPI网络，根据Degree值的大小选出核心基因。再通过Metascape网站对核心基因分别进行GO分析和KEGG分析。分析富集结果并结合文献报道，最后将关键蛋白与田黄方有效成分在DiscoveryStudio2021软件上进行分子对接，预测田黄方调节T2DM合并NAFLD的的可能作用机制。<br>　　3.验证田黄方干预T2DM合并NAFLD小鼠糖脂代谢紊乱的作用机制。<br>　　RT-PCR法检测小鼠肝脏组织中炎症相关因子，脂肪酸合成、脂肪酸摄取和脂肪酸β氧化相关因子以及葡萄糖生成酶相关因子的mRNA表达情况。进一步通过RT-PCR法和Westernblot检测上述网络药理学预测的信号通路中关键分子的基因和蛋白表达水平。<br>　　研究结果：<br>　　1.由HFD+STZ诱导的模型组小鼠出现胰岛素抵抗、血糖升高、血脂水平升高，病理结果见模型组肝脏组织内脂滴增大，发生脂质异位沉积，且肝脏糖原含量下降，胰腺组织中胰岛萎缩。田黄方可抑制T2DM合并NAFLD小鼠体重增长，改善葡萄糖耐量，增加胰岛素敏感性，修复肝脏损伤，调控脂联素分泌，调节脂肪酸和糖代谢。<br>　　2.通过网络药理学筛选得到田黄方中42个有效成分，相对应的潜在靶点基因有207个。根据PPI互作关系，得到核心化合物11个，核心基因22个；在GO分析中，涉及营养水平、脂多糖、激素水平、氧化物、脂肪酸代谢、葡萄糖稳态等生物过程，受蛋白激酶、跨膜受体蛋白激酶、核受体、脂质、氧化还原酶、胰岛素受体底物结合等分子功能调控。KEGG分析结果表明其可能主要通过胰岛素抵抗、TNF信号通路、钙信号通路、AMPK信号通路等改善T2DM合并NAFLD。结合文献报道，将从核心通路中筛选出来的靶点CREBBP及其连接蛋白ATF3与田黄方核心成分进行分子对接，发现均具有较好的结合活性。<br>　　3.田黄方可抑制炎症相关因子、糖异生相关因子以及脂肪酸合成和摄取相关因子的表达，增加脂肪酸β氧化相关因子基因表达；下调ATFmRNA表达，上调CRLS1和ChREBPmRNA表达水平；降低肝脏ATF3蛋白表达、升高CRLS1和ChREBP蛋白表达水平。<br>　　研究结论：<br>　　1.田黄方能够明显改善T2DM合并NAFLD小鼠的糖脂代谢紊乱，改善胰岛功能，调节胰岛素抵抗，增强葡萄糖耐受，改善肝脏脂质异位沉积、糖原消耗及肝损伤。<br>　　2.网络药理学研究发现田黄方改善T2DM合并NAFLD的作用机制可能与CREBBP/ATF3相关通路有关。验证结果发现田黄方可抑制T2DM合并NAFLD小鼠炎症、糖异生以及脂肪酸合成和摄取，增加脂肪酸β氧化，抑制胰岛素抵抗，从而有助于恢复肝脏正常代谢功能，作用机制与调节CRLS1-ATF3/ChREBP信号通路有关。