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摘要骨性关节炎（OA）是一种发病率高、临床负担重、以关节软骨退变为主要特征的慢性骨科疾病。OA的主要临床表现为慢性疼痛和关节活动障碍，严重影响着老年患者的生活质量，并且随着社会人口的日益老龄化，高患病率将给国家和社会造成沉重的经济压力。且目前临床上针对OA的非手术治疗都是以缓解症状为主的姑息性治疗方法，尚缺乏真正意义上逆转软骨退变、干预疾病进展的治疗方法。因此，着手于骨关节炎的治疗靶点，研发新型治疗药物，在疾病早期针对性地延缓甚至逆转软骨退变是当前临床治疗的重中之重。<br>　　近年来，随着对OA研究的深入，发现OA的发病机制不仅与关节软骨有关，还与软骨下骨重塑有关。破骨细胞是软骨下骨重塑的主要贡献者，破骨细胞过度活化导致骨基质中释放各种因子调节软骨细胞代谢并参与软骨退化。因此，通过抑制破骨细胞分化来恢复异常的软骨下骨重塑，成为治疗OA的新靶点。天然化合物因其安全性高、稳定性好，更容易被患者接纳，近年来逐渐成为研究的热点。先前研究表明，植物来源药物穗花衫双黄酮（Amentoflavone，AF）已显示出有效的抗破骨细胞分化和抗炎特性。然而，关于AF在OA病理过程中具体调节功能的研究却未见报道。鉴于炎症与破骨细胞分化和细胞外基质（ECM）之间的体内平衡紊乱密切相关，我们推测AF在治疗OA中具有显著的疗效及无限的应用潜力。为验证以上假设，我们主要拟开展以下研究：（1）探究AF对IL-1β诱导小鼠软骨细胞炎症反应及ECM稳态的影响及其分子机制；（2）探究AF对RANKL诱导小鼠破骨细胞分化的影响及其分子机制；（3）探究AF对小鼠骨关节炎是否具有治疗作用。<br>　　本文分为以下三部分：<br>　　第一部分：AF在体外对小鼠软骨细胞炎症反应及ECM稳态的影响及分子机制研究<br>　　研究目的：探究AF对于IL-1β诱导的小鼠软骨细胞炎症反应及ECM稳态的影响及其机制。<br>　　研究方法：（1）通过细胞计数试剂盒-8（cell counting Kit-8，CCK-8）实验检测不同浓度AF在IL-1β (10 ng/mL)存在或不存在的情况下对小鼠软骨细胞增殖的影响。<br>　　（2）IL-1β刺激小鼠原代软骨细胞，构建OA的体外模型；通过软骨细胞高密度培养以及使用甲苯胺蓝染色检测AF对ECM稳态的影响。<br>　　（3）通过定量PCR、Western blot和Elisa法检测AF对炎症介质（iNOS、 COX-2、IL-6和TNF-α）表达的影响。<br>　　（4）通过定量PCR和Western blot检测AF对ECM代谢产物（Col2a1、SOX9、MMP13 和 ADAMTS5 等）表达的影响；通过免疫荧光实验（ Aggrecan 和Collagen-Ⅱ）进一步验证AF对ECM稳态的影响。<br>　　（5）通过Western blot检测AF对小鼠软骨细胞NF-κB/JNK/ERK信号通路的影响；同时通过免疫荧光检测AF对IL-1β诱导下p65入核的影响。<br>　　研究结果：（1）在0-10μM浓度范围内，AF对小鼠原代软骨细胞增殖活性没有影响。AF在安全浓度范围（0-10μM）内能剂量依赖性地减弱IL-1β对小鼠软骨细胞的活性抑制作用。<br>　　（2）甲苯胺蓝染色结果显示软骨细胞在 IL-1β 刺激下蓝色染色强度降低，使用AF处理后，蓝色染色强度呈逐渐增加，且加深的程度与AF的浓度呈正相关。<br>　　（3）AF处理后明显抑制软骨细胞在IL-1β刺激后iNOS、COX-2、IL-6和TNF-α等炎症介质的表达。<br>　　（4）同时AF处理后明显抑制软骨细胞在IL-1β刺激下MMP13、ADAMTS5的表达，并上调Col2a1、SOX9的表达；通过Aggrecan和Collagen-Ⅱ的免疫荧光实验我们可以看到，仅使用IL-1β刺激的软骨细胞荧光染色很浅，而加入AF与IL-1β共处理后，两者的免疫荧光染色明显增强。<br>　　（5）AF显著抑制了小鼠软骨细胞在IL-1β刺激下IκBα的降解，以及p65、JNK、ENK的磷酸化表达，p65的入核转位也被AF显著抑制。<br>　　结论：AF通过抑制NF-κB/JNK/ERK信号通路稳定软骨细胞在IL-1β刺激下的炎症反应和ECM稳态。<br>　　第二部分：AF在体外对小鼠破骨细胞分化的影响及分子机制研究<br>　　研究目的：探究AF对于RANKL诱导的破骨细胞分化的影响及其机制。<br>　　研究方法：（1）通过细胞计数试剂盒-8（cell counting Kit-8，CCK-8）实验检测不同浓度AF对小鼠BMMs细胞、Raw264.7细胞增殖的影响。<br>　　（2）通过RANKL体外诱导破骨细胞分化，TRAP染色和肌动蛋白环实验检测AF对破骨细胞形成的影响。<br>　　（3）通过定量PCR和Western blot检测AF对破骨细胞特异性标志物（c-fos、NFATc1、TRAP、DC-STAMP、Calcitonin receptor和V-ATPase d2等）表达的影响。<br>　　（4）通过Western blot检测AF对小鼠破骨细胞NF-κB/JNK/ERK信号通路的影响；同时通过免疫荧光检测AF对破骨细胞分化过程中p65入核的影响。<br>　　研究结果：（1）在0-10μM浓度下，AF对小鼠BMMs细胞和RAW264.7细胞增殖活性没有影响。<br>　　（2）在M-CSF和RANKL细胞因子共同刺激下，小鼠BMMs细胞被诱导为成熟的多核破骨细胞，F-肌动蛋白环的数量也显著增加。而使用AF处理后， TRAP染色阳性的破骨细胞数量和面积以及肌动蛋白环的数量逐渐减少，且随着AF浓度的增加，减少的效果更明显。<br>　　（3）定量 PCR 结果显示 AF 处理后明显抑制破骨细胞特异性基因 c-fos、NFATc1、TRAP、DC-STAMP、Calcitonin receptor和V-ATPase d2的表达；Western Blot实验进一步验证了上述结果，AF显著降低了c-fos、NFATc1的蛋白表达。<br>　　（4）AF显著抑制了RANKL诱导破骨细胞形成过程中IκBα的降解，以及 JNK、ENK的磷酸化表达，p65的入核转位也被AF显著抑制。<br>　　研究结论：AF通过抑制NF-κB/JNK/ERK信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。<br>　　第三部分：AF对DMM诱导的小鼠骨关节炎的作用研究<br>　　研究目的：在体内探究AF对小鼠骨关节炎是否具有治疗作用。<br>　　研究方法：（1）通过离断小鼠内侧半月板，构建骨关节炎小鼠体内DMM模型。<br>　　（2）模型构建成功1周后，在实验组（DMM+AF组）腹腔注射内AF，对照组（DMM组）及假手术组（Sham组）注射PBS；每2天注射一次，持续8周，然后收集小鼠膝关节标本。<br>　　（3）利用关节软骨切片的HE染色、番红O固绿染色以及OARSI评分评估各组小鼠软骨退变程度；通过免疫组化实验（MMP13 和 COL2a1）进一步验证AF在OA期间对ECM稳态的影响。<br>　　（4）通过切片TRAP染色实验检测AF对OA小鼠软骨下骨骨重塑状态的影响，同时采用免疫荧光检测p-p65的表达。<br>　　研究结果：（1）HE染色和番红O固绿染色结果显示，与Sham组相比，在 DMM 组中观察到大量的蛋白聚糖丢失和软骨侵蚀。而与 DMM 组相比，注射AF 治疗后显著地抑制了蛋白聚糖丢失和软骨侵蚀。同样，膝关节 OARSI 评分得到一致的结果。此外，组织切片免疫组化实验检测发现MMP13和COL2a1的表达被AF治疗后抑制。<br>　　（2）经AF治疗后，软骨下骨中TRAP阳性的多核细胞数量和面积均减少。<br>　　（3）组织切片免疫荧光检测发现p-p65表达被AF治疗后抑制。<br>　　研究结论：AF对小鼠骨关节炎关节软骨退变和软骨下骨骨丢失具有双重保护作用。