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摘要目的结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）是结核病（Tuberculosis，TB）的病原菌，其常规治疗手段是抗生素治疗，但Mtb的耐药性愈演愈烈，抗生素疗法陷入困境，因此噬菌体疗法重新受到重视。噬菌体疗法具有良好的应用前景，但存在着侵染效率低、给药途径不理想等问题，其中细菌自身的限制修饰系统（Restriction-Modificationsystem，R-M系统）是阻碍噬菌体侵染的重要原因。细菌的R-M系统会降解外来的噬菌体DNA，使其不能发挥裂解细菌的作用，因此是结核病噬菌体疗法的重要限制因素。Rv2528c是Mtb的模式菌株H37Rv中唯一一个R-M系统的限制酶候选基因，可能识别并切割多种类型的甲基化修饰DNA。因此其在异源表达宿主中表达可能产生遗传毒性，即通过降解宿主的带有甲基化修饰的基因组DNA，抑制宿主菌的生长。本研究旨在鉴定Rv2528c的生物学功能及其识别的DNA修饰类型，为优化治疗用噬菌体的DNA序列及甲基化修饰类型提供指导依据，从而提高结核病噬菌体疗法的疗效并最终促进结核病的防控。<br>　　方法首先克隆目的基因，将Rv2528c编码序列克隆至蛋白表达载体pET44b上，命名为Rv2528c-pET44bΔ。将空载体pET44bΔ和Rv2528c-pET44bΔ分别转化入表达宿主JM110、Top10和BL21(DE3)pLysS中，筛选出带有目的基因的重组表达菌株，分别测定生长曲线，以初步确认Rv2528c对大肠杆菌宿主的遗传毒性；利用0.8M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导蛋白表达菌株BL21/Rv2528c中蛋白的表达，然后进行镍柱亲和层析纯化蛋白。使用酶标仪（SpectraMaxM5）、TUNEL试剂盒和流式细胞仪，对含有Rv2528c表达载体的JM110、Top10和BL21(DE3)pLysS菌株的生长曲线和Rv2528c的遗传毒性进行检测。使用11种商业化的DNA甲基转移酶（MTase）对不含任何DNA修饰的pRSFDuet质粒分别进行体外修饰，将不同甲基化修饰类型的质粒通过电击转化BL21/Rv2528c和BL21/pET44bΔ菌株，并对转化子分别进行计数。计数资料用SPSS25.0软件进行分析，定量资料若满足正态性，则用两独立样本比较的t检验；若不满足正态性，则用两独立样本的秩和检验。以Plt;0.05为差异具有统计学意义。通过比较其转化效率的差异，确定Rv2528c识别的DNA甲基化类型。最后通过AlphaFold预测Rv2528c的蛋白三维结构，用superposition方法比较其与EcoKMrr蛋白的三维结构，揭示其功能差异的结构基础。<br>　　结果1构建的pET44bΔ和Rv2528c-pET44bΔ表达质粒，经琼脂糖凝胶电泳及基因测序验证序列正确，构建成功。2Rv2528c体外切割试验，纯化的Rv2528c蛋白对商业化DNAMTase修饰的pRSFDuet质粒底物，仅产生微弱的非特异性降解，该现象与Rv2528c所属的Mrr家族蛋白的性质一致。3对含有pET44bΔ和Rv2528c-pET44bΔ质粒的JM110、Top10和BL21(DE3)pLysS菌株的生长曲线的测定，显示带有Rv2528c的BL21(DE3)pLysS菌株生长明显迟缓，而JM110和Top10菌株正常生长。4对带有pET44bΔ和Rv2528c-pET44bΔ质粒的BL21(DE3)pLysS菌株进行TUNEL细胞凋亡检测，显示Rv2528c的表达会导致明显的基因组DNA损伤。5经SPSS25.0软件统计分析，用11种商业化DNAMTase修饰的pRSFDuet质粒电转入BL21/pET44bΔ菌株的电转效率均高于电转入BL21/Rv2528c菌株的电转效率（Plt;0.05）。6结合生物学和统计学分析，在对Rv2528c体内识别的DNA甲基化类型研究中，携带M.HhaI、M.MspI、M.BamHI、CpG、M.AluI、M.HaeIII、M.EcoGII和M.TaqI修饰的质粒对BL21/Rv2528c菌株的转化效率，比携带相同修饰质粒对BL21/pET44b菌株的转化效率显著降低；而经M.HpaII或M.EcoRI修饰的质粒，或从Top10中提取得到的质粒，受Rv2528c的限制较小。7使用AlphaFold预测的Rv2528c和EcoKMrr的蛋白质三维结构比较显示，两者中间区域的两个α-螺旋的易位，导致两个蛋白的整体结构差异较大，是为两个蛋白功能差异的结构基础。8Rv2528c识别的DNA修饰类型与EcoKMrr基本相似，可以明显限制M.HhaI、M.MspI、M.BamHI、CpG、M.AluI、M.HaeIII、M.EcoGII和M.TaqI的甲基化修饰。<br>　　结论1Rv2528c在E.coliBL21(DE3)pLysS菌株中具有遗传毒性和DNA损伤现象。2Rv2528c与甲基化修饰DNA的不兼容性可以保护宿主免受有害的外源DNA的侵入和调控。3Rv2528c可以识别M.HhaI、M.MspI、M.BamHI、CpG、M.AluI、M.HaeIII、M.EcoGII和M.TaqI的甲基化修饰。4Rv2528c识别甲基化类型与EcoKMrr相似，但是两者之间也有区别，其结构差异可能是造成两者区别的主要原因。