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摘要目的<br>　　肺癌是全球范围内病死率最高的恶性肿瘤之一，对人类健康造成了严重的威胁，在我国其发病率和死亡率均位居首位。肺癌主要分为小细胞肺癌（SmallCellLungCancer，SCLC）和非小细胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC），而NSCLC的患病率约占肺癌发病者的85%。非小细胞肺癌发病隐匿，多数患者被确诊时已属中晚期，并且患者的5年生存率较低。目前针对非小细胞肺癌的早期诊断缺少有效的标志物，导致错过最佳治疗时机，且手术后复发率极高、易转移。因此，寻找非小细胞肺癌早期诊断的新型生物标志物及探索其发病机制是十分必要的。近年来研究结果发现各种微小RNA（microRNA）在非小细胞肺癌中异常表达，并参与细胞的增殖、分化及转移等过程。而外泌体可以转运miRNA，稳定的存在于循环系统中，作为潜在的新型非侵入性生物标志物，可用于癌症的诊断。本研究旨在寻找非小细胞肺癌潜在的新型血清外泌体miRNA诊断标志物，探究其可能的治疗靶点。<br>　　研究方法<br>　　1.下载TCGA数据库肺癌miRNA的数据，使用R-3.5.2与RStudio-1.1.456进行数据整理和结果的可视化，获得分子表达矩阵，对矩阵中的数据标准化并获得差异表达的miRNA分子。<br>　　2.按标准收集训练集血清样本健康对照74例和NSCLC患者74例，验证集血清健康对照75例和NSCLC患者73例。收集过程中避免溶血，两步离心去除血清中的细胞碎片等杂质，记录样本的信息，储存于-80℃冰箱中。<br>　　3.使用试剂盒ExoQuickTMsolution提取血清外泌体，通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和外泌体标记蛋白TSG101和CD9Westernblot鉴定提取的外泌体。提取血清外泌体RNA，并测定其浓度和纯度。逆转录miRNA，使用实时荧光定量PCR检测差异表达的miRNA分子在血清外泌体中的表达情况。<br>　　4.分析训练集中qRT-PCR结果得到差异miRNA分子，绘制受试者工作曲线（ROC），计算曲线下面积（AUC），计算验证集差异分子的AUC。根据筛选出的分子建立Logistic回归模型，ROC曲线下面积评估模型的诊断效能。<br>　　5.分别使用miRNAagomir和miRNAantagomir转染细胞，使miR-1269a分子在NSCLC细胞中过表达或抑制，分析其对细胞生物学功能的影响。采用CCK8实验、EdU细胞增殖及克隆形成实验检测细胞增殖能力；Transwell实验和Matrigel实验检测细胞迁移、侵袭能力。裸鼠皮下成瘤实验体内验证低表达miR-1269a显著抑制NSCLC细胞增殖。<br>　　6.采用mirDIP、miRDB和TargetScan三个生物信息学工具预测miR-1269a的潜在靶点。TCGA下载肺癌转录组counts数据，整理后分析靶点的表达量。构建靶基因FOXO1野生型和突变型双荧光素酶报告载体，进行双荧光素酶报告基因实验验证其与miR-1269a直接结合。在NSCLC细胞中过表达或抑制miR-1269a后，采用qRT-PCR和WesternBlot验证其对FOXO1表达量的影响。<br>　　7.运用qRT-PCR和WesternBlot实验挑选FOXO1表达量相对较高的细胞转染小干扰，抑制FOXO1的表达。通过CCK8实验、EdU细胞增殖及克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化；Transwell实验和Matrigel实验检测细胞迁移、侵袭能力。<br>　　8.共转染miR-1269aantagomir和si-FOXO1，WesternBlot验证蛋白水平的恢复作用，进行CCK8实验、EdU细胞增殖、克隆形成实验、Transwell实验和Matrigel实验，与对照组比较验证恢复效果，进一步证明miR-1269a通过FOXO1在NSCLC细胞中发挥促癌作用。<br>　　结果<br>　　1.TCGA数据库下载数据包括肺腺癌522例，肺鳞癌504例，癌旁正常组织45例。差异表达后筛选FDR＜0.05并且logFC＞2的miRNA分子，有76个。按照表达量从大到小进行排序，再选取logFC大于2的前十位分子作为候选miRNA分子。<br>　　2.透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和Westernblot实验结果证明使用ExoQuickTMsolution可以从血清中分离出外泌体并且能保持外泌体膜的完整性。<br>　　3.qRT-PCR筛选非小细胞肺癌血清外泌体中差异表达的miRNA，从训练集筛选出4个显著上调的miRNA分子：hsa-miR-9-3p，hsa-miR-205-5p，hsa-miR-210-5p和hsa-miR-1269a，其AUC分别为0.827(95%CI=0.756~0.884，灵敏度=78.4%，特异度=83.8%)、0.806(95%CI=0.733~0.866，灵敏度=68.9%，特异度=85.1%)、0.839(95%CI=0.770~0.894，灵敏度=83.8%，特异度=83.9%)和0.852(95%CI=0.784~0.905，灵敏度=64.9%，特异度=89.2%)。通过Logistic回归模型建立公式logit(P=NSCLC)=0.7237-hsa-miR-9-3p×0.0854-hsa-miR-205-5p×0.0041-hsa-miR-210-5p×0.1082-hsa-miR-1269a×0.0935，验证集AUC分别为0.741、0.742、0.788和0.793。ROC曲线分析建立的模型对非小细胞肺癌具有较好的诊断效能，其AUC为0.915，灵敏度为0.77，特异度为0.89。将4-miRNA分子模型带入到验证组中，其AUC为0.878，并且四分子联合诊断效能优于其中任何一个单独诊断。<br>　　4.选取四个分子中诊断效能最好的hsa-miR-1269a进行了非小细胞肺癌生物学行为研究，CCK8实验、EdU细胞增殖及克隆形成实验显示过表达miR-1269a促进细胞增殖，而降低其表达则显著抑制细胞增殖。Transwell实验和Matrigel实验证明miR-1269a的表达显著影响NSCLC细胞的迁移、侵袭能力。裸鼠体内实验验证了miR-1269a能明显抑制NSCLC细胞增殖。<br>　　5.预测得到FOXO1是miR-1269a的潜在靶标，双荧光素酶实验证实两者直接结合。在mRNA水平和蛋白水平上，FOXO1在NSCLC细胞中的表达情况均受miR-1269a表达量的影响，进一步验证了两者能结合。通过功能实验发现低表达FOXO1可以促进A549细胞的增殖、迁移和侵袭。<br>　　6.通过rescue实验发现共转染miR-1269aantagomir和si-FOXO1后，miR-1269a低表达对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的减弱可以得到恢复，miR-1269a可以通过靶向FOXO1影响NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。<br>　　结论<br>　　1.hsa-miR-9-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-210-5p和hsa-miR-1269a四个分子在非小细胞肺癌血清外泌体中显著高表达，并且对NSCLC具有较高的诊断价值。<br>　　2.基于Logistic回归分析构建的血清外泌体四分子模型对NSCLC具有较高的诊断效能，有望作为NSCLC诊断的非创伤性分子标志物。<br>　　3.miR-1269a可能通过影响NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，发挥促癌作用。<br>　　4.miR-1269a可通过靶向FOXO1调控非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，有望成为NSCLC治疗的潜在靶点。