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摘要研究目的:<br>　　本研究拟从BPDE外环境和缺氧内环境暴露两个方面，分别探究其导致女性滋养层细胞铁死亡而引发流产的损害效应，并阐明非编码RNA在这一过程的调控机制。<br>　　研究方法:<br>　　第一部分 BPDE上调铁代谢和促进GPX4蛋白降解而导致滋养层细胞铁死亡<br>　　1、利用Western blot和RT-qPCR，检测铁输入、铁输出、铁储存基因的表达；<br>　　2、利用CCK8、LDH、MDA、GPx、ROS和铁离子试剂盒，检测BPDE处理或敲低GPX4的细胞中铁死亡的表型；<br>　　3、采用蛋白稳定性实验，检测GPX4蛋白的稳定性；<br>　　4、利用体外泛素化分析实验，检测GPX4的泛素化。<br>　　第二部分 新lncRNA HZ06在滋养层细胞缺氧通过HIF1α-SUMO/NCOA4通路导致铁死亡而诱发复发性流产中的作用和调控机制<br>　　1、按照伦理委员会要求，本研究对已收集的12例病因不明的复发性流产患者绒毛组织样本（RM）和12例健康对照组绒毛组织样本（HC），利用Western blot、RT-qPCR和免疫组化IHC方法，检测组织中流产指标分子HOXA10、缺氧关键分子HIF1α及其下游靶基因CA9、VEGF的表达；检测组织中铁死亡相关指标（MDA、游离Fe2+水平、GPX4和Ferritin蛋白）；同时利用Pearson方法分析“缺氧与流产”，“缺氧与铁死亡”和“铁死亡与流产”指标间的相关性；<br>　　2、采用物理缺氧（气体比例1% O2、94% N2和5% CO2）和化学缺氧400 μM CoCl2方法，建立滋养层细胞体外缺氧模型；利用CCK8、LDH、MDA、GPx、ROS和铁离子试剂盒，检测缺氧处理的细胞中铁死亡的表型；利用Western blot、RT-qPCR，检测缺氧对NCOA4 mRNA和蛋白的表达；利用ChIP实验，检测HIF1α与NCOA4 DNA启动子区的结合；利用IP或Co-IP实验，检测缺氧条件下HIF1α的SUMO化修饰水平的变化；利用ChIP-re-ChIP以及DNA pulldown实验，检测SUMO化的HIF1α和总HIF1α与生物素标记的NCOA4 DNA启动子区的结合；利用双荧光素酶报告基因实验，检测SUMO化的HIF1α激活NCOA4转录的能力；<br>　　3、在缺氧细胞中，过表达或干扰lnc-HZ06，利用CCK8、LDH、MDA、GPx、ROS和铁离子试剂盒，检测lnc-HZ06对细胞铁死亡的表型的影响；利用Western blot、RT-qPCR，检测lnc-HZ06对NCOA4 mRNA和蛋白表达的影响；利用ChIP实验，检测HIF1α与lnc-HZ06 DNA启动子区的结合；利用IP或Co-IP实验，检测了lnc-HZ06对HIF1α的SUMO化修饰水平的影响；利用ChIP-re-ChIP以及DNA pulldown实验，检测SUMO化的HIF1α和总HIF1α与生物素标记的lnc-HZ06 DNA启动子区的结合；利用双荧光素酶报告基因实验，检测SUMO化的HIF1α激活lnc-HZ06转录的能力；<br>　　4、在HC和RM绒毛组织中（n = 12），利用RT-qPCR、Western blot、IP实验和免疫组化实验，检测组织中lnc-HZ06、HIF1α的SUMO化、NCOA4 mRNA和蛋白表达的变化；同时利用Pearson方法，分析“lnc-HZ06与NCOA4 mRNA和蛋白表达”，“lnc-HZ06与铁死亡”和“lnc-HZ06与流产”指标之间的相关性；<br>　　5、在HC和RM绒毛组织中（n = 4），利用ChIP-re-ChIP以及DNA pulldown实验，检测了SUMO化的HIF1α和总HIF1α与NCOA4或lnc-HZ06 DNA启动子区的结合；<br>　　6、采用缺氧（气体比例10% O2、90% N2）处理的孕鼠构建流产模型，收集胚胎绒毛膜组织，检测缺氧对孕鼠胚胎，缺氧标志（鼠源Hif1α的表达及其下游靶基因Ca9和Vegf mRNA）的影响；<br>　　7、在缺氧孕鼠-流产模型中，收集胚胎绒毛膜组织，检测鼠源 lnc-hz06 和Hif1α-Sumo的影响；<br>　　8、在缺氧孕鼠-流产模型中，收集胚胎绒毛膜组织，检测铁死亡标志（MDA，游离铁、Gpx4、Fth1、Ncoa4）的影响；同时利用Pearson方法，分析“lnc-hz06与Ncoa4蛋白表达”，“lnc-hz06与铁死亡”指标之间的相关性；<br>　　研究结果:<br>　　第一部分 BPDE上调铁代谢和促进GPX4蛋白降解而导致滋养层细胞铁死亡<br>　　1、不同浓度的BPDE（0，0.5，1.0 μM）处理的滋养层Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中，BPDE 可上调铁离子输入基因（TFR、HFE）、铁离子储存基因（FTH、FTL、FTMT）和铁离子输出基因（FPN1、CP）的mRNA水平，且这些基因的表达上调随着BPDE浓度增加而增加，具有一定浓度依赖性；<br>　　2、BPDE处理可增加细胞内游离Fe2+水平，上调过氧化酶COX-2和NOX-1 mRNA和蛋白水平；<br>　　3、BPDE处理可诱发滋养层细胞铁死亡（显著降低细胞活力和总谷胱甘肽过氧化物酶活性，显著增加细胞死亡率、细胞脂质过氧化和ROS水平），促进滋养层细胞铁死亡。但BPDE引发的细胞铁死亡可被特异性铁死亡抑制剂（Fer-1）所抑制；<br>　　4、敲低 GPX4 可诱发滋养层细胞铁死亡（显著降低细胞活力和总谷胱甘肽过氧化物酶活性，显著增加细胞死亡率、细胞脂质过氧化和ROS水平）。<br>　　第二部分 新lncRNA HZ06在滋养层细胞缺氧通过HIF1α/NCOA4通路导致铁死亡而诱发复发性流产中的作用和调控机制<br>　　1、在RM中，流产标志物HOXA10的蛋白水平降低，而缺氧诱导因子HIF1α的蛋白水平及其下游靶基因CA9、VEGF的mRNA水平均高表达；<br>　　2、在RM中，铁死亡相关指标也变化明显（MDA、游离Fe2+水平和COX-2的mRNA水平均显著上调，总GPx活性、GPX4蛋白和Ferritin铁蛋白水平显著下调）；<br>　　3、Pearson分析显示，在RM中，HIF1α蛋白的相对表达水平与流产关键标志物HOXA10蛋白的相对表达水平呈负相关（K = -0.0544，P = 0.0067），MDA水平和游离 Fe2+水平与流产标志物 HOXA10 的蛋白水平呈显著负相关（K = -0.1618，P = 0.0118；K = -0.4576，P ＜ 0.0001），HIF1α蛋白水平与铁死亡典型指标MDA的水平和游离Fe2+水平呈正相关（K = 0.274，P = 0.0004；K = 0.1314， P = 0.0008）；<br>　　4、缺氧可导致滋养层 Swan 71 和 HTR-8/SVneo 细胞铁死亡，进一步敲低NCOA4后，缺氧诱导的细胞铁死亡明显减少；<br>　　5、缺氧可上调 NCOA4 的 mRNA 和蛋白水平，而敲低 HIF1α 可显著下调NCOA4 的 mRNA 和蛋白水平。ChIP 实验和荧光素酶报告基因实验表明 HIF1α可结合到NCOA4的启动子区，并激活其转录。因此，HIF1α是NCOA4的转录因子；<br>　　6、缺氧可促进HIF1α发生SUMO化修饰，且主要是SUMO化的HIF1α介导NCOA4的转录，进而上调其表达；<br>　　7、缺氧条件下，lnc-HZ06 通过下调去 SUMO 酶 SENP1 而上调 HIF1α 的SUMO化水平，从而增强SUMO化的HIF1α介导的NCOA4转录过程，最终促进细胞的铁死亡；此外，SUMO化的HIF1α也能促进lnc-HZ06的转录；<br>　　8、缺氧条件下，lnc-HZ06和SUMO化的HIF1α形成了一个正向的自反馈循环，并促进了NCOA4的转录，从而诱导滋养层细胞的铁死亡。<br>　　研究结论:<br>　　第一部分 BPDE上调铁代谢和促进GPX4蛋白降解而导致滋养层细胞铁死亡<br>　　1、BPDE可诱导滋养层细胞铁死亡；<br>　　2、BPDE可下调GPX4的蛋白水平，产生过量的ROS并诱导脂质过氧化累积；<br>　　3、BPDE可通过蛋白酶体途径，下调GPX4蛋白水平，最终诱导滋养层细胞铁死亡。<br>　　第二部分 新lncRNA HZ06在滋养层细胞缺氧通过HIF1α-SUMO/NCOA4通路导致铁死亡而诱发复发性流产中的作用和调控机制<br>　　1、新lnc-HZ06在缺氧的女性滋养层细胞、不明原因复发性流产组织和缺氧-流产孕鼠的胎盘绒毛膜组织中表达增加；<br>　　2、HIF1α是NCOA4的转录因子；在缺氧条件下，主要是SUMO化的HIF1α作为转录因子，参与转录调控；<br>　　3、Lnc-HZ06通过下调SENP1上调HIF1α的SUMO化修饰水平，进而上调HIF1α的转录活性；<br>　　4、SUMO化的HIF1α也可作为lnc-HZ06的转录因子，并在缺氧中形成了一个自动调节反馈回路。一旦这个反馈回路在缺氧条件下启动，NCOA4 就会表达上调，并导致铁死亡；<br>　　5、发现lnc-HZ06/ HIF1α-SUMO/NCOA4轴可诱导滋养层细胞铁死亡进而引发流产；<br>　　6、发现lnc-HZ06和NCOA4可能作为流产的潜在干预靶标。