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摘要为了应对一些公共卫生问题，有必要对与它们相关的DNA-蛋白质复合物的特性进行深入研究。<br>　　研究目的:<br>　　在单分子水平上研究与P. aeruginosa多重耐药性、神经发育性疾病和癌症存在紧密关联的DNA-蛋白质复合物的特性及其致病机制，以发展和改进相关疾病的防治策略，提出新的检测方法、检测靶标，并将研究发现应用于相关疾病的检测中，以实现疾病的早发现、早诊断、早治疗，从而更有力地应对公共卫生挑战、减轻公共卫生负担。<br>　　研究方法:<br>　　第一部分：铜绿假单胞菌噬菌体PaP1 DNA聚合酶gp90链取代合成机制及调控研究<br>　　本研究采用磁镊单分子力谱技术，以力钳（force clamp）模式在200 Hz的采样率下实时观测DNA聚合酶gp90的SDDS过程及其调控，测量了其合成速率、延伸性及停留时间（dwell time, DT）。实验中，设置磁铁每5 s下降0.01 mm以接近反应池表面，外力的加载范围约为4皮牛（piconewton, pN）至20 pN。<br>　　第二部分：组蛋白H1E突变核小体的特性研究<br>　　采用力坡（force ramp）模式以200 Hz的采样率测量H1E突变核小体的特性，检测了不同核小体的力学稳定性及自我重塑能力。实验中，设置外力以0.05 pN/s的加载率匀速加载，外力加载范围约为0 pN至30 pN。<br>　　第三部分：组蛋白H2A及H2B突变四聚核小体的特性研究<br>　　采用force ramp模式以430 Hz的采样率测量组蛋白H2A、H2B突变四聚核小体的特性，检测了不同四聚核小体的展开平衡力。实验中，设置外力每步增加0.05 pN，每步测量时间为10 s至40 s，外力加载范围约为0 pN至7 pN。<br>　　研究结果:<br>　　第一部分：铜绿假单胞菌噬菌体PaP1 DNA聚合酶gp90链取代合成机制及调控研究<br>　　本研究详细探究了单个gp90及无核酸外切酶活性的（exonuclease minus, exo-）gp90 exo-组成的DNA复制体的SDDS机制及其调控因素。本研究鉴定了gp90与DNA复制叉单链尾巴（flap）处的新结合状态，并捕获了野生型（wild-type, wt）gp90重复结合和释放flap的二态跳跃转变，这有助于理解单个DNA 聚合酶 SDDS 的启动。研究结果进一步表明，高脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate, dNTP）浓度会增加SDDS速率，但不影响核酸外切（exonuclease, Exo）速率；而DNA底物中高胞嘧啶（cytosine, C）和鸟嘌呤（guanine, G）含量会降低SDDS速率，但会增加Exo速率。同时，dNTP浓度对SDDS和Exo的持续合成能力影响不如底物GC含量大；而高GC含量则会降低两者。增加dNTP浓度会缩短从SDDS 到SDDS以及从SDDS到Exo的DT；而增加GC含量对前者影响不大，但会缩短后者。增加dNTP浓度会延长从Exo到SDDS以及从Exo到Exo的DT；而增加GC含量对前者影响不大，但会缩短后者。此外，研究发现gp90 SDDS的特点及dNTP浓度、GC含量和外力对其调控与T7或T4 DNA聚合酶表现出不同特点。<br>　　第二部分：组蛋白H1E突变核小体的特性研究<br>　　本研究阐明了无 wt-H1E 结合及结合 wt-H1E 的核小体；H1E-123fs 及H1E-157fs 移码（ frameshift, fs ）突变核小体；H1E-123x 及 H1E-157x 截断（truncated，以x表示）突变核小体；以及末端连接移码突变保守氨基酸（amino acid, AA）序列的H1E+38AA核小体的展开特性。首先测量了上述不同核小体的力学稳定性，未结合wt-H1E的核小体外圈展开临界力的平均值（mean）与标准差（standard deviation, SD）为4.3 ± 1.5 pN（n=36），结合wt-H1E的核小体外圈展开临界力为9.2 ± 3.5 pN（mean ± SD, n=100），二者有统计学差异（P＜0.0001）；H1E-123fs核小体的外圈展开临界力为13.4 ± 5.9 pN（mean ± SD, n=288），H1E-157fs核小体外圈展开的临界力为13.5 ± 5.8 pN（mean ± SD, n=174），二者与wt-H1E核小体相比都有统计学差异（P＜0.0001）；H1E-123x核小体的外圈展开临界力为12.9 ± 5.2 pN（mean ± SD, n=87），H1E-157x核小体的外圈展开临界力为16.5 ± 3.9 pN（mean ± SD, n=39），二者与wt-H1E核小体相比具有统计学差异（P＜0.0001）；H1E+38AA核小体的外圈展开临界力为4.4 ± 1.6 pN（mean ± SD, n=36），显著低于wt-H1E核小体（P＜0.0001）。研究结果表明，带有致病和截断突变H1E的核小体，其外圈力学稳定性远远高于wt核小体。研究结果进一步阐明了H1E的致病移码突变能够使核小体表现出异于正常核小体的自我重塑能力。此外，研究也阐明了去泛素化酶usp21与H1E移码突变核小体的相互作用，发现了二者都无法使核小体重塑的双向相互作用。<br>　　第三部分：组蛋白H2A及H2B突变四聚核小体的特性研究<br>　　本研究揭示了wt四聚核小体以及H2A-G22R、H2B-K117E、H2A-G22R+H2B-K117E和H2A-G22R+H2B-Q48A突变四聚核小体的特性，测量并比较了它们的展开平衡力。wt四聚核小体的展开平衡力为4.6 ± 0.7 pN（mean ± SD, n=36）；H2A-G22R四聚核小体的展开平衡力为2.0 ± 0.7 pN（mean ± SD, n=32），显著低于wt四聚核小体（P＜0.0001）；H2B-K117E四聚核小体的展开平衡力为2.6 ± 0.6 pN （ mean ± SD, n=22 ），显著低于wt四聚核小体（ P＜0.0001 ）；H2A-G22R+H2B-K117E突变四聚核小体的展开平衡力为4.3 ± 0.7 pN（mean ± SD, n=32），与wt四聚核小体无差异；H2A-G22R+H2B-Q48A突变四聚核小体的展开平衡力为2.4 ± 0.8 pN（mean ± SD, n=32），显著低于wt四聚核小体（P＜0.0001）。通过对比wt与突变四聚核小体的展开平衡力，发现H2A-G22R、H2B-K117E与H2A-G22R+H2B-Q48A均能够通过破坏原有氢键而破坏核小体间的相互作用。其中，H2A-G22R的平衡力稍小于H2B-K117E，说明碱性氨基酸之间的互斥对原有氢键的破坏相较于脂肪族氨基酸的羰基与酸性氨基酸之间的互斥更为严重。H2A-G22R与H2A-G22R+H2B Q48A的平衡力无差异，表明该位点上氢键对于核小体间相互作用的维持作用远大于疏水相互作用。H2A-G22R+H2B-K117E的平衡力与wt四聚核小体无差异，说明突变能够引起该位点上氢键与离子键的转换，且它们均能维持四聚核小体的稳定性。本研究结果证明了四聚核小体的一步或两步展开模式，以及组蛋白H2A和H2B点突变对四聚核小体结构稳定性的影响。<br>　　研究结论:<br>　　1.gp90在链取代合成DNA的过程中，SDDS活性与Exo活性位点频繁切换，dNTP浓度、GC含量和外力可调控gp90的SDDS和Exo速率、延伸性以及两种活性位点转换时的DT，这与T7或T4 DNA聚合酶表现出不同特点。<br>　　2.致病的移码突变H1E可赋予核小体自我重塑的能力，并增强核小体的力学稳定性，而不含有致病突变保守序列的H1E则不能使核小体自我重塑。<br>　　3.H2A、H2B特定点突变四聚核小体的展开平衡力弱于wt四聚核小体，表明点突变可通过破坏核小体间的相互作用而破坏四聚核小体的结构稳定性。<br>　　研究创新性:<br>　　1.选题新颖：研究了P. aeruginosa噬菌体PaP1 DNA聚合酶gp90的SDDS机制，及多种因素对其调控；阐明了导致ID和ASD等神经发育性疾病的移码突变H1E对核小体力学稳定性和自我重塑能力的影响，解释了可能的致病机制；在单个四聚核小体水平上揭示了H2A、H2B点突变对其结构稳定性的破坏，为组蛋白突变的致癌机制提供了新的认识。<br>　　2.方法新颖：采用单分子力谱技术磁镊研究与重要公共卫生问题相关的DNA-蛋白质复合物的特性，能够精确揭示罕见或瞬态事件及结构的动态变化。<br>　　3.具有公共卫生意义：为应对P. aeruginosa相关公共卫生问题的噬菌体疗法提供了遗传水平的解释和改进方向；核小体、四聚核小体的力学稳定性与自我重塑能力可作为ID、ASD及癌症等疾病的新检测靶标和潜在的治疗靶点。