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摘要N-末端乙酰化（Nt-乙酰化）是真核生物中含量最丰富的蛋白质修饰之一，影响人类和拟南芥中80%-90%的可溶性蛋白。然而，目前对植物蛋白质N端乙酰化修饰的生物学功能了解甚少。在真核生物中，一些Nats需要不同的催化和辅助亚基（如NatA、NatB、NatC和NatD）。Naa50是N末端乙酰基转移酶NatE复合物的催化亚基。我们之前的研究发现，Naa50的缺失会导致拟南芥的不育。因此，我们探究了Naa50调控拟南芥雌雄配子体发育的机制，主要的研究成果和结论如下：<br>　　1.拟南芥Naa50功能缺失导致植株不育<br>　　为了探究Naa50在植物发育过程中的功能，我们在ABRC上订购了Naa50的T-DNA插入突变体naa50-1（CS350943）和naa50-2（CS843868）。通过分析我们发现这两个突变体的T-DNA都是插在了Naa50的第一个内含子中。qPCR分析显示，突变体T-DNA的插入完全破坏了Naa50的表达。表型观察发现纯合突变体表现出侏儒、角果变短的表型。在体视显微镜下观察纯合突变体角果中的种子，发现突变体的种子败育。<br>　　2.拟南芥Naa50功能缺失导致雄配子体致死<br>　　体视显微镜、亚历山大染色（Alexanderstaining）和扫描电子显微镜（Scaning Electron Microscopy，SEM）观察发现naa50-1突变体的花粉外壁表现为异常的塌陷表型，这些形态发育异常的花粉也失去了其活性。Naa50基因组DNA与GUS报告基因的融合完全恢复了naa50-1突变体的表型。<br>　　3.拟南芥Naa50功能缺失导致绒毡层PCD加速<br>　　树脂包埋和半薄切片结果显示，在花粉发育的第10期，naa50-1的绒毡层相较于野生型PCD加速，且花粉严重空泡化。第11期，naa50-1的绒毡层完全降解，花粉干瘪、塌陷，而野生型的绒毡层直至第12期才完全降解。这些结果表明，Naa50是通过延缓绒毡层程序性细胞死亡，进而促进花粉发育的。<br>　　4.Naa50特异性表达于退化的绒毡层细胞和成熟的花粉中<br>　　我们构建了gNaa50:GUS转基因植株来检测Naa50的表达模式，发现Naa50只在成熟的花的花药和柱头中表达，在早期较小的花中不表达。进一步将gNaa50:GUS转基因植株的花药进行GUS染色后制成树脂切片，发现Naa50特异性的表达在9-11期花药的绒毡层以及12-13期成熟的小孢子和整个细胞层中，与之前绒毡层PCD加速的结果一致。这些结果说明Naa50的表达模式和突变体的表型是相关联的。<br>　　5.Naa50缺失影响拟南芥花药发育的几种途径<br>　　我们对naa50-1突变体的闭合花蕾进行了RNA-seq转录组分析。与野生型相比， naa50-1突变体中2475个基因的表达发生了显著变化（调整后P＜0.05）。与绒毡层PCD相关的关键执行子半胱氨酸蛋白酶CEP1在naa50-1突变体中，表达量显著上调。与花粉发育相关的Bcp1，来自花药绒毡层的孢子体花粉外壳蛋白（sPCPs）以及对小孢子的外壁模式形成和细胞完整性至关重要的SWEET8和CALS5，在naa50-1突变体中表达显著下调。Naa50的缺失还影响了花粉特异转录因子的表达。<br>　　6.Naa50缺失导致的雄性不育是由孢子体效应引起的<br>　　我们用野生型Naa50+/+和杂合突变体naa50+/-进行正反交实验，结果显示naa50-1突变体的雌、雄配子体传递效率正常。因此，naa50-1突变体的雄性不育是由孢子体效应引起的。<br>　　7.拟南芥Naa50功能缺失不影响柱头组织的功能<br>　　之后，我们又对拟南芥的雌配子体进行了研究。先用野生型的花粉分别授给野生型和naa50-1，在授粉4小时、12小时和24小时后取延伸的角果进行苯胺蓝染色（Aniline Blue Staining）。结果显示，野生型和naa50-1中花粉管的萌发情况基本一致。因此， Naa50功能缺失并没有影响柱头组织的功能。<br>　　8.拟南芥Naa50功能缺失导致胚囊发育异常<br>　　我们将在卵细胞中特异性表达的基因DD45连接GUS报告基因的转基因植株ProDD45:GUS与naa50+/-杂交，结果发现，与野生型相比，naa50-1的成熟胚珠中几乎全都没有GUS信号，只有少数雌蕊中的一个胚珠有GUS信号，也就是说大部分胚珠中没有卵细胞的存在，所以检测不到信号。此外，我们还利用七细胞八核的maker基因驱动核靶向荧光蛋白YFP，即ProES:NLS-YFP植株与naa50+/-杂交，发现野生型胚珠中有7个细胞核，而naa50-1突变体中几乎都没有荧光信号，只有极少数胚珠中显示出一个或三个细胞核。这些结果表明，在大孢子细胞发生过程中，Naa50对于功能大孢子的有丝分裂过程起着至关重要的作用。<br>　　9.拟南芥Naa50功能缺失导致胚珠无法正常吸引花粉管<br>　　我们使用在花粉中特异性表达的基因LAT52驱动报告基因GUS，即ProLAT52:GUS的野生型转基因材料，同时授粉野生型和突变体，然后在授粉后12、24和36小时，取雌蕊组织进行GUS染色分析。在对照组中，几乎所有的胚珠均有GUS信号被检测到，而naa50-1中，所有的胚珠中都没有检测到GUS信号。这些证据表明，突变体胚珠不能正常的吸引花粉管，这也进一步印证了我们的推测，突变体胚囊发育异常导致花粉管不能正常进入到胚珠中，双受精过程受阻，最终造成了角果败育。<br>　　综上，Naa50在花药发育过程中平衡绒毡层细胞的降解，并通过影响多种途径在花粉发育中发挥重要作用。同时也在雌配子体中卵细胞的正常发育和雌雄配子体之间的识别发挥功能。