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摘要背景与目的：<br>　　幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，H.pylori）是引起胃炎、消化性溃疡、胃癌等常见消化道系统疾病的病原体。H.pylori成功在复杂的胃部环境中定植与致病，需要毒力因子的协同表达及营养物质的供给。据报道，双功能酶SpoT具有合成酶和水解酶活性，能够合成和水解四（五）磷酸鸟苷(p)ppGpp。在H.pylori中，双功能酶SpoT影响细菌相关毒力因子表达，从而影响H.pylori在胃部定植及致病，SpoT参与H.pylori生物膜形成进而介导细菌产生耐药性，表明SpoT对H.pylori致病性和耐药性的产生起重要作用，但其表达的调控机制不明。已知在H.pylori基因组中仅存在编码为数不多的转录因子，大量文献报道它们共同调控着细菌代谢和致病性等相关基因的表达。本课题将利用调控蛋白基因缺失株筛选抑制spoT表达的转录调控蛋白，并进一步探究其调控双功能酶spoT表达的分子机制。<br>　　方法与结果：<br>　　1转录调控蛋白对spoT表达的影响<br>　　1.1筛选抑制spoT表达的转录调控蛋白<br>　　菌株Hp26695及其14株调控基因缺失株（Hp26695ΔcrdR、Hp26695ΔflgR、Hp26695Δhup、Hp26695ΔrpoN、Hp26695Δfur、Hp26695ΔhsrA、Hp26695ΔcheY、Hp26695ΔfliA、Hp26695ΔnikR、Hp26695ΔhspR、Hp26695Δhp0222、Hp26695ΔhrcA、Hp26695Δhp0564和Hp26695Δhp1021）（均为本实验室构建并保存）液体培养24h，提取RNA，qPCR检测spoT表达。结果显示，与Hp26695相比，Hp26695ΔnikR和Hp26695ΔfliA的spoT表达量显著上升（P＜0.05），其余12株调控基因缺失株的spoT表达量下降或不变。表明抑制spoT表达的调控蛋白有NikR和FliA，其中以NikR最为显著（P＜0.01）。<br>　　1.2验证NikR负调控spoT表达<br>　　菌株Hp26695、Hp26695ΔnikR和Hp26695ΔnikR/nikR（nikR回补株，本实验室构建并保存）液体培养24h，提取RNA，qPCR检测spoT表达。结果显示，与Hp26695相比，Hp26695ΔnikR的spoT表达量显著上升（P＜0.01）；与Hp26695ΔnikR相比，Hp26695ΔnikR/nikR的spoT表达量显著下降（P＜0.05），证明NikR抑制spoT表达。<br>　　1.3镍离子对NikR抑制spoT表达的影响<br>　　有研究表明，NikR蛋白是镍依赖性调节蛋白，NikR与镍离子结合以控制基因转录的激活或抑制。为探究镍离子是否影响NikR对spoT表达的抑制，进行如下实验：将Hp26695和Hp26695ΔnikR液体培养24h（处理组添加NiCl2，终浓度为20μM，以提供镍离子，对照组不做处理）。提取RNA，qPCR检测spoT表达。结果显示，Hp26695+NiCl2组较Hp26695组spoT表达显著下降（P＜0.01），Hp26695ΔnikR+NiCl2组spoT表达显著高于Hp26695+NiCl2组（P＜0.05），而Hp26695ΔnikR和Hp26695ΔnikR+NiCl2两组间spoT表达无明显差异（P＞0.05），说明镍离子增强NikR对spoT的抑制作用。<br>　　2NikR调控spoT表达的分子机制<br>　　2.1qPCR检测NikR调控spoT的转录起始位点<br>　　有文献通过dRNA-seq技术研究报道了H.pylori中所有基因的转录起始位点，数据显示spoT存在三个转录起始位点，分别位于spoT上游的-248bp（位于基因hp0776上游）、-1012bp（位于基因hp0777上游）和-1781bp（位于基因hp0778上游）。通过将菌株Hp26695、Hp26695ΔnikR和Hp26695ΔnikR/nikR液体培养24h，提取菌株RNA，qPCR检测hp0776、hp0777和hp0778的基因表达。结果显示，与Hp26695相比，Hp26695ΔnikR的hp0776、hp0777与hp0778表达量上调（P＜0.05）；与Hp26695ΔnikR相比，Hp26695ΔnikR/nikR的hp0776、hp0777与hp0778的表达量下调（P＜0.05）,表明NikR抑制hp0776、hp0777与hp0778的表达。结合spoT基因结构图，表明NikR调控的转录起始位点位于hp0778上游，共同调控hp0778、hp0777、hp0776和spoT的表达，推测NikR通过结合至hp0778启动子区域（Php0778）调控spoT的表达。<br>　　2.2EMSA检测NikR与spoT启动子相互作用<br>　　2.2.1生物信息学分析spoT启动子Php0778序列中的NikR结合位点<br>　　将文献报道的NikR保守结合位点与Php0778启动子序列利用在线软件CLUSTALW进行序列比对，分析预测NikR在Php0778启动子上可能的结合位点。结果表明，Php0778启动子上游序列5’-TTTTGTAATCTTCTAAAAAATCTTT-3’与NikR保守结合位点具有较高的同源度，提示NikR可能结合于该位点，进而发挥转录调控作用。<br>　　2.2.2构建spoT启动子探针Php0778<br>　　PCR扩增hp0778启动子片段,将片段与pLB载体连接，成功构建pLB-hp0778重组质粒。通过带有AlexaFluo700荧光标记的引物从载体中扩增，成功构建spoT启动子探针Php0778。<br>　　2.2.3EMSA验证NikR与Php0778结合<br>　　研究表明，NikR作为镍依赖性反应的特异性转录调控因子，镍离子作为辅因子以调节NikR与DNA的结合。通过EMSA实验以检测NikR与Php0778结合情况（实验组在EMSA结合体系中添加NiCl2，终浓度为0.4mM，对照组不添加）。结果显示，在缺乏NiCl2的条件下，NikR未与Php0778结合；当在EMSA结合体系中添加NiCl2后，蛋白浓度为8μM的Strep-NikR与12.5ng的Php0778探针在凝胶中出现明显阻滞条带，表明NikR结合spoT启动子Php0778。<br>　　2.3NikR与Php0778结合位点定点突变<br>　　2.3.1构建结合位点突变探针Php0778-mut<br>　　将NikR与Php0778结合位点序列突变为5’-GTGGACGGGCTTCTGGTTTTCGAAT-3’，利用相关克隆技术成功构建突变重组质粒pLB-hp0778-mut。通过带有AlexaFluo700荧光标记的引物从载体中扩增，成功构建结合位点突变探针Php0778-mut。<br>　　2.3.2EMSA检测NikR与Php0778-mut相互作用<br>　　通过EMSA实验以检测NikR与Php0778-mut结合情况。结果显示，随着NikR蛋白浓度逐渐增加，在凝胶中均未出现明显阻滞条带，说明NikR未与Php0778-mut结合。<br>　　结论：<br>　　1、抑制H.pylorispoT表达的转录调控蛋白有NikR和FliA，其中以NikR最为显著。<br>　　2、在镍离子参与下，NikR通过与spoT启动子Php0778结合阻遏spoT表达。