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PPXY motif调控Sonic Hedgehog信号通路跨膜蛋白受体Patched 1降解的作用机制

摘要背景:异常活化的SonicHedgehog(Shh)信号通路关联着癌症等许多疾病的发生发展。Shh跨膜蛋白受体Patched1(Ptch1)为负向调控该信号通路的核心分子。Shh配体与Ptch1结合会促使Ptch1离开纤毛以及后续的内化与降解,进而引发通路活化。已知具有两个PPXYmotif介导其降解,分别在第6到第7跨膜结构域(以下称MiddleLoopPPXY)以及C端(以下称C-termialPPXY)。然而,这两个PPXYmotif如何调控Ptch1降解的机制尚不明确。<br>  目的:本研究将探究Ptch1的两个PPXYmotif,MiddleLoopPPXY以及C-terminalPPXY,在调控Ptch1离开纤毛以及后续的内化与降解上的影响与差异,并进一步阐明在Shh信号通路活化时,这两个PPXYmotif调控Ptch1降解又有何变化。<br>  方法:本研究将利用稳定表达Ptch1wildtype、MiddleLoopPPXY与C-terminalPPXYmotif的单突变体和共同突变体的NIH/3T3细胞,以及在293T细胞过表达外源Ptch1wildtype及上述突变体来进行以下实验:(1)以免疫荧光技术观察Ptch1wildtype和PPXYmotif突变体定位于纤毛的情况;(2)以生物素标记细胞膜蛋白后,观察生物素标记的细胞膜Ptch1wildtype和PPXYmotif突变体蛋白水平;(3)以放线菌酮(CHX)抑制新蛋白合成后,检测Ptch1wildtype和PPXYmotif突变体蛋白稳定性;(4)使用溶酶体抑制剂和蛋白酶体抑制剂,鉴定Ptch1wildtype和PPXYmotif突变体的主要降解路径;(5)使用荧光探针lysotracker标定溶酶体后,观察Ptch1wildtype和PPXYmotif突变体与溶酶体共定位。<br>  结果:当Shh配体不存在时,MiddleLoopPPXY突变,尤其当MiddleLoop与C-terminalPPXY同时突变,会导致(1)Ptch1定位于纤毛的量增加,且呈现分布于纤毛的底或顶部;(2)Ptch1会在细胞膜中积累;(3)Ptch1的蛋白稳定性增高。另外,我们发现虽然溶酶体及蛋白酶体皆介导Ptch1降解,但C-terminalPPXY主要介导Ptch1溶酶体降解。进一步发现,当Shh配体存在时,Shh的结合能促使C-terminalPPXY未突变的Ptch1(1)由细胞膜显著内化;(2)蛋白稳定性显着下降;(3)与溶酶体共定位明显增加。<br>  结论:本研究揭示了Ptch1主要依赖MiddleLoopPPXY调控Ptch1离开纤毛,并影响Ptch1蛋白内化与降解,但Shh配体的结合会促使Ptch1转而依赖C-terminusPPXY,进而加速其离开纤毛,并且内化后通过溶酶体进行降解。由于目前Shh通路的治疗靶点存在许多抗性机制,这些发现将有助于我们了解Ptch1在Shh信号通路中的降解机制,为Ptch1作为新的治疗靶点提供工作基础。

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