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摘要目的：眼底新生血管（Retinalneovascularization，RNV）疾病可威胁到患者眼功能，甚至会导致失明。血管新生和炎症反应是RNV发展中主要的疾病现象，细胞因子如血管内皮生成因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）和肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactoralpha，TNF-α）在RNV血管生成和炎症反应中起到关键作用。抗VEGF疗法是目前临床上治疗RNV的主要方法，但仍存在不足。RNV发生发展机制尚不明确且复杂，迫切需要更有效的药物进行治疗。本课题组自主设计和构建了抗VEGF/TNF-α双特异性单域抗体（PV5-3），观察其对缺氧诱导人视网膜色素上皮细胞系19（Adultretinalpigmentepithelialcellline-19，ARPE-19）上清液刺激的人脐静脉内皮细胞（Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC）构成的RNV模型的作用及机制研究，为临床治疗RNV提供新的理论依据。<br>　　方法：<br>　　1.RNV体外缺氧模型建立<br>　　1.1建立物理法缺氧ARPE-19细胞模型。细胞分4组：24h正常组、24h模型组（37℃、1％O2+5%CO2培养箱培养）、48h正常组、48h模型组（37℃、1%O2+5%CO2培养箱培养）；Westernblot检测缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α）蛋白的累积；qRT-PCR检测HIF-1α、VEGFmRNA表达水平。<br>　　1.2物理法缺氧ARPE-19细胞48h模型验证。免疫荧光检测缺氧对HIF-1α蛋白在细胞内核易位的影响；EdU观察缺氧对细胞增殖活性的影响；Westernblot检测缺氧对磷酸化核因子-κB（Phospho-Nuclearfactorkappa-B，P-NF-κB）、核因子-κB（Nuclearfactorkappa-B，NF-κB）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）、TNF-α、VEGF蛋白表达的影响；qRT-PCR检测缺氧对IL-1β、IL-18、TNF-αmRNA表达的影响。<br>　　1.3观察缺氧诱导ARPE-19细胞上清液对HUVEC细胞的影响，建立RNV体外模型。细胞分2组：正常组：取ARPE-19细胞37℃，5%CO2培养箱培养48h上清液作用于HUVEC细胞24h；模型组：取ARPE-19细胞37℃，1%O2，5%CO2培养箱培养48h上清液作用于HUVEC细胞24h。分别通过EdU、划痕和小室实验检测缺氧诱导ARPE-19细胞上清液对HUVEC细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响；Westernblot检测缺氧诱导ARPE-19细胞上清液对HUVEC细胞血管内皮生长因子受体2（Vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，VEGFR2）信号通路相关蛋白表达水平的影响。<br>　　2.PV5-3双特异性单域抗体的构建与验证<br>　　2.1MTT法观察抗TNF-α单域抗体（T01）抑制TNF-α损伤小鼠成纤维细胞（Mousefibroblasts-929，L929）增殖抑制作用，验证其结合TNF-α的活性；划痕实验观察抗VEGF单域抗体（V5412）对hVEGF165刺激HUVEC细胞水平迁移能力的影响，验证其结合VEGF的活性。<br>　　2.2构建原核表达PV5-3融合蛋白工程菌：根据大肠杆菌密码子偏好性进行基因序列优化，设计PV5-3基因，在其末端加入由6个组氨酸构成的His标签；构建至pET-28a原核表达载体，转化感受态细胞E.coliBL21(DE3)，筛选获得含有目的基因的工程菌株。<br>　　2.3通过工程菌复苏、诱导表达、收集、破碎、洗涤、溶解、透析、脱盐获得PV5-3蛋白。<br>　　2.4采用ELISA法分析PV5-3对VEGF/TNF-α的亲和力，MTT法、PI/Hoechst双染法观察PV5-3对TNF-α损伤L929细胞的保护作用，验证PV5-3结合TNF-α的活性；划痕实验检测PV5-3对hVEGF165刺激HUVEC细胞水平迁移能力的影响，验证PV5-3结合VEGF的活性；Westernblot检测PV5-3对hVEGF165刺激HUVEC细胞VEGFR2信号通路相关蛋白表达的影响。<br>　　3.PV5-3对缺氧ARPE-19细胞及缺氧诱导ARPE-19细胞上清液刺激的人脐静脉内皮细胞的作用及机制研究<br>　　3.1研究PV5-3对缺氧ARPE-19细胞的影响。实验分5组：正常组（Control）、模型组（Model）、T01组（Model+3000nMT01）、V5412组（Model+3000nMV5412）、PV5-3组（Model+3000nMPV5-3）。Westernblot检测PV5-3对P-NF-κBp65、NF-κBp65、IL-1β、IL-18、TNF-α、VEGF蛋白表达水平的影响；qRT-PCR检测PV5-3对IL-1β、TNF-α、VEGFmRNA的表达水平的影响。<br>　　3.2研究PV5-3对缺氧诱导ARPE-19细胞上清液刺激的HUVEC细胞的影响。实验分5组：正常组（ARPE-19细胞正常组上清液培养）、模型组（ARPE-19细胞缺氧诱导上清液培养）、T01组（ARPE-19细胞T01组上清液培养）、V5412组（ARPE-19细胞V5412组上清液培养）、PV5-3组（ARPE-19细胞PV5-3组上清液培养）。用EdU实验、划痕实验和小室实验检测PV5-3对缺氧诱导ARPE-19细胞上清液刺激的HUVEC细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，Westernblot检测PV5-3对缺氧诱导ARPE-19细胞上清液刺激的HUVEC细胞VEGFR2信号通路相关蛋白表达水平的影响。<br>　　结果：<br>　　1.RNV体外缺氧模型建立<br>　　1.1ARPE-19细胞实验结果<br>　　1.1.1ARPE-19细胞缺氧模型建立条件。Westernblot和qRT-PCR实验结果确定ARPE-19细胞缺氧模型建立条件为37℃、1%O2、5%CO2培养48h，以下简称缺氧。<br>　　1.1.2ARPE-19细胞缺氧模型建立条件确认。免疫荧光结果显示，缺氧导致ARPE-19细胞发核易位；EdU结果显示，缺氧抑制ARPE-19细胞增殖；Westernblot结果显示，缺氧ARPE-19细胞P-NF-κB、IL-1β、IL-18、TNF-α、VEGF蛋白表达上调；qRT-PCR结果显示，缺氧ARPE-19细胞IL-1β、IL-18、TNF-αmRNA表达水平上调。<br>　　1.2HUVEC细胞实验结果<br>　　1.2.1EdU、划痕、小室实验结果显示，缺氧诱导ARPE-19细胞上清液对HUVEC细胞增殖、迁移、侵袭能力均有促进作用。<br>　　1.2.2Westernblot实验结果显示，缺氧诱导ARPE-19细胞上清液使HUVEC细胞VEGFR2蛋白磷酸化增强，增强下游相关蛋白AKT、mTOR、ERK1/2、P38MAPK磷酸化。<br>　　2.PV5-3的构建与验证<br>　　2.1T01与V5412活性验证。MTT法检测TNF-α对L929细胞增殖抑制作用，IC50为0.3584ng/mL，2ng/mLTNF-α能杀伤大部分L929细胞，以2ng/mLTNF-α作用后续造模所需浓度；MTT与PI/Hoechst双染实验结果显示，T01给药组（4800nM、2400nM、1200nM）抑制TNF-α对L929细胞的增殖抑制作用，即T01具有与TNF-α结合细胞活性；划痕实验结果显示，V5412抑制hVEGF165刺激的HUVEC细胞水平迁移，即V5412具有与VEGF结合细胞活性。<br>　　2.2PV5-3设计构建合成。(1)成功构建了一株PV5-3融合蛋白的E.coliBL21(DE3)工程菌。(2)工程菌在37℃和1mMIPTG条件下诱导5h可获得大量以包涵体形式存在的重组蛋白。(3)包涵体经过破碎、洗涤、溶解、复性、脱盐后，可获得高纯度的目的蛋白。<br>　　2.3PV5-3活性验证。ELISA抗原抗体亲和力分析结果显示，PV5-3对TNF-α/VEGF均具有亲和力；MTT与PI/Hoechst双染实验结果显示，PV5-3对TNF-α损伤L929细胞有保护作用，即PV5-3具有与TNF-α结合细胞活性，PV5-3对TNF-α损伤L929细胞EC50为216.7nM；划痕实验结果显示PV5-3抑制hVEGF165刺激的HUVEC细胞水平迁移，即PV5-3具有与VEGF结合细胞活性；Westernblot实验结果显示，PV5-3能够抑制hVEGF165刺激HUVEC细胞VEGFR2蛋白磷酸化，抑制下游相关蛋白AKT、mTOR、ERK1/2、P38MAPK磷酸化。<br>　　3.PV5-3对缺氧ARPE-19细胞及缺氧诱导ARPE-19细胞上清液刺激的HUVEC细胞的作用及机制研究<br>　　3.1ARPE-19细胞实验结果<br>　　3.1.1Westernblot实验结果显示，PV5-3抑制缺氧ARPE-19细胞P-NF-κB、IL-1β、IL-18、TNF-α、VEGF蛋白表达，且抑制作用强于T01和V5412。<br>　　3.1.2qRT-PCR实验结果显示，PV5-3下调缺氧ARPE-19细胞VEGF、TNF-αmRNA表达水平。<br>　　3.2HUVEC细胞实验结果<br>　　3.2.1EdU实验结果显示，PV5-3抑制缺氧诱导ARPE-19细胞上清液对HUVEC细胞增殖的作用。<br>　　3.2.2划痕实验结果显示，PV5-3抑制缺氧诱导ARPE-19细胞上清液对HUEVC细胞水平迁移作用，抑制作用显著强于T01，与V5412无统计学差异。<br>　　3.2.3Transwell小室垂直迁移实验结果显示，PV5-3抑制缺氧诱导ARPE-19细胞上清液对HUVEC细胞垂直迁移作用，抑制作用强于T01和V5412。<br>　　3.2.4Transwell小室侵袭实验结果显示，PV5-3抑制缺氧诱导ARPE-19细胞上清液对HUVEC细胞侵袭能力，抑制作用强于T01和V5412。<br>　　3.2.5Westernblot实验结果显示，PV5-3与V5412显著抑制缺氧诱导ARPE-19细胞上清液对HUVEC细胞VEGFR2蛋白磷酸化的作用，同时抑制下游相关蛋白AKT、mTOR、ERK1/2、P38MAPK磷酸化，抑制作用强于T01。<br>　　结论：<br>　　1.缺氧诱导ARPE-19细胞上清液刺激HUVEC细胞可成功建立RNV体外模型。<br>　　2.成功构建并制备了具有高亲和性和细胞活性抗VEGF/TNF-α双特异性单域抗体PV5-3。<br>　　3.PV5-3通过TNF-α/NF-κB信号通路成功抑制缺氧ARPE-19细胞炎症因子的表达，在RNV体外模型中发挥抗炎保护作用。<br>　　4.PV5-3通过VEGFR2信号通路成功抑制缺氧诱导ARPE-19细胞上清液刺激的HUVEC细胞增殖、迁移、侵袭能力，在RNV体外模型中发挥抗血管生成保护作用。