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摘要目的<br>　　研究骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）促进移植后造血重建的作用及机制，进一步探究其对造血干细胞移植后免疫调控的影响。<br>　　方法<br>　　1.骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定<br>　　制备骨髓间充质干细胞，通过离心贴壁法获得BMSCs，取第二代细胞，在显微镜下观察细胞形态，行细胞形态学鉴定，通过流式细胞术检测细胞免疫表型，并通过分化诱导实验鉴定BMSCs的多向分化功能。<br>　　2.BMSCs促进移植后造血重建的作用及机制研究<br>　　2.1制备人CD34+造血干细胞（Hematopoieticstemcells，HSC），通过磁珠分选获得CD34+HSC,并通过流式细胞术检测细胞免疫表型。<br>　　2.2将BMSCs、CD34+HSC、CD34+HSC+BMSCs分别置于24孔板中，加入集落形成培养基，孵育8天后，记录集落数。<br>　　2.3将CD34+HSC与BMSCs的共培养4周，每周计数非粘附活细胞，并拍摄图像。<br>　　2.4免疫缺陷鼠NCG小鼠清髓后，对其进行人CD34+造血干细胞移植，构建人源化造血干细胞移植小鼠模型。实验分组如下：<br>　　（1）对照组：单纯白消安清髓。<br>　　（2）HSC移植组：白消安清髓后给予CD34+HSC。<br>　　移植后6周眼球静脉采血，流式细胞术检测鼠CD45和人CD45表达水平。<br>　　2.5在人源化造血干细胞移植小鼠模型基础上，评估BMSCs对造血重建的影响。实验分组如下：<br>　　（1）对照组：单纯白消安清髓。<br>　　（2）HSC移植组：白消安清髓后给予CD34+HSC。<br>　　（3）BMSCs共回输组：白消安清髓后给予CD34+HSC+BMSCs。<br>　　每3天眼球静脉采血1次，进行血细胞分析。<br>　　3.BMSCs在体外参与免疫调控的作用及机制研究<br>　　3.1对人外周血单核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）进行羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluoresceinsuccinimidylaminoester，CFSE）染色，用抗CD3/CD28抗体刺激，分析BMSCs浓度依赖性的免疫抑制作用。共培养72h后，比较阳性对照组PBMC增殖反应，探究BMSCs对PBMC增殖的影响。<br>　　3.2应用流式细胞术分析CD4+/CD8+细胞表面活化标志物CD69、CD25和HLA-DR的表达，探究BMSCs对淋巴细胞体外激活的影响。<br>　　3.3应用流式细胞术分析PBMC表面标志物CD25、FoxP3、IFN-γ、IL-4、IL-17的表达，探究BMSCs对体外T细胞亚群的影响。<br>　　3.4混合淋巴细胞共培养评估BMSCs对同种异体T细胞免疫反应的影响及机理。<br>　　结果<br>　　1.成功分离培养并鉴定了骨髓间充质干细胞<br>　　成功制备了骨髓间充质干细胞，其形态呈长梭形，细胞均一，呈高度一致；BMSCs表面表达CD73、CD90、CD105，不表达CD45，经分化诱导实验后,可以被诱导分化为脂肪细胞，成骨细胞及成软骨细胞。<br>　　2.BMSCs促进移植后造血重建的作用<br>　　2.1成功制备了人CD34+造血干细胞，流式细胞术证实其表面高表达CD34。<br>　　2.2BMSCs组未形成集落，CD34+HSC组形成集落数为（43.75±7.93）个，CD34+HSC+BMSCs组形成集落数为（80.00±7.02）个，相比于CD34+HSC组，CD34+HSC+BMSCs组形成的集落数更多。<br>　　2.3CD34+HSC组非粘附细胞数分别为（W1：2.31±0.36；W2：2.75±0.62；W3：2.89±0.79；W4：3.34±0.29）*10^4个，CD34+HSC+BMSCs组非粘附细胞数分别为（W1：2.64±0.56；W2：8.25±3.70；W3：7.62±1.25；W4：11.49±2.28）*10^4个，CD34+HSC+BMSCs+细胞因子组非粘附细胞数分别为（W1：2.73±0.37；W2：12.98±2.40；W3：10.64±1.75；W4：13.20±4.02）*10^4个，相比于CD34+HSC组，BMSCs在非炎性及炎性环境下都能够促进CD34+HSC体外增殖。<br>　　2.4成功构建了人源化造血干细胞移植小鼠模型。CD34+HSC组小鼠外周血表达人CD45，表明人CD34+造血干细胞成功植入。<br>　　2.5移植CD34+HSC后的人源化造血干细胞移植小鼠在35天后恢复血象，而移植了CD34+HSC+BMSCs后的人源化造血干细胞移植小鼠在28天后恢复血象，BMSCs共回输组血象更快恢复。<br>　　3.BMSCs在体外参与免疫调控的作用<br>　　3.1Control组CFSE阳性细胞比例为（2.33±0.22）%，刺激组CFSE阳性细胞比例为（10.34±0.83）%，1/5BMSCs组CFSE阳性细胞比例为（2.73±0.71）%，1/5BMSCs+细胞因子组CFSE阳性细胞比例为（2.31±0.45）%，1/10BMSCs组CFSE阳性细胞比例为（2.48±0.54）%，1/10BMSCs+细胞因子组CFSE阳性细胞比例为（2.97±1.11）%，相比于刺激组，加入BMSCs后CFSE阳性细胞数显著减少，BMSCs在非炎性及炎性环境下皆具有淋巴细胞增殖抑制作用。<br>　　3.2BMSCs与淋巴细胞共培养后，淋巴细胞表面活化标志物CD25、CD69、HLA-DR水平均显著降低，BMSCs在非炎性及炎性环境下皆具有淋巴细胞活化抑制作用。<br>　　3.3Control组Th1、Th17和Treg细胞比例分别为（8.92±0.75）%，（0.22±0.09）%，0%，刺激组Th1、Th17和Treg细胞比例分别为（4.52±0.62）%，（0.03±0.03）%，（1.77±0.34）%，1/5BMSCs组Th1、Th17和Treg细胞比例分别为（13.96±2.12）%，（0.19±0.07）%，（5.44±1.58）%，1/5BMSCs+细胞因子组Th1、Th17和Treg细胞比例分别为（13.12±1.39）%，（0.14±0.04）%，（5.71±1.98）%，1/10BMSCs组Th1、Th17和Treg细胞比例分别为（13.66±1.42）%，（0.12±0.02）%，（3.29±1.50）%，1/10BMSCs+细胞因子组Th1、Th17和Treg细胞比例分别为（12.76±0.96）%，（0.11±0.01）%，（3.30±0.79）%，BMSCs与淋巴细胞共培养后，BMSCs在非炎性及炎性环境下皆能通过影响Th1、Th17和Treg细胞，参与免疫调控。<br>　　3.4Control组CFSE阳性细胞比例为（2.31±1.90）%，刺激组CFSE阳性细胞比例为（91.32±0.54）%，1/5BMSCs组CFSE阳性细胞比例为（77.02±0.89）%，1/5BMSCs+细胞因子组CFSE阳性细胞比例为（75.14±1.56）%，1/10BMSCs组CFSE阳性细胞比例为（60.62±0.98）%，1/10BMSCs+细胞因子组CFSE阳性细胞比例为（57.18±2.11）%，加入BMSCs后，淋巴细胞活化增殖显著减少，BMSCs在非炎性及炎性环境下皆能抑制同种异体T细胞免疫反应的作用。<br>　　结论<br>　　通过体外细胞学实验和动物模型，揭示了BMSCs能够促进移植后造血重建，并具有较好的免疫调控作用。