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摘要角膜上皮作为一种机械屏障维持角膜内环境的稳定。一旦角膜上皮和基底膜被破坏，周围的角膜上皮细胞会分泌多种细胞因子，激活成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，导致不可逆的角膜混浊甚至失明。角膜上皮细胞的迁移率直接影响角膜上皮闭合速率，影响角膜修复。治疗角膜上皮损伤的常见临床方法有人工泪液、自体血清、抗炎药物、羊膜覆盖等，虽然临床治疗展现出一定的疗效，但都易引发不同的并发症。基因疗法等新方法特别是非编码微小RNA（microRNA，miRNA）出现在临床治疗的视野中，利用miRNA加速角膜上皮细胞迁移实现角膜上皮损伤修复十分具有意义。miRNA 是天然的强基因表达调节剂，是生物体基本生物学过程的关键介质。研究表明：miRNA 24-3p可以通过激活EGFR和/或CTGF的磷酸化增强表皮生长因子信号传导和CTGF的转录，实现细胞的迁移。据此，我们猜想可以通过控制角膜上皮细胞中miRNA 24-3p水平激活EGFR和/或 CTGF 的磷酸化，调节角膜上皮损伤愈合以及上皮稳态。目前关于 miRNA 24-3p对角膜上皮损伤修复的作用研究鲜有报道。我们拟通过体外细胞生物学和体内实验动物模型验证miRNA 24-3p对角膜上皮损伤疾病的治疗效果，并开发miRNA 24-3p多级递送系统促进碱烧伤角膜上皮损伤愈合，为角膜上皮损伤修复提供一种新的治疗思路。<br>　　首先，我们通过将miRNA 24-3p转染于角膜上皮细胞中对其生物学功能进行研究，细胞增殖、细胞趋化性、细胞迁移和RT-PCR实验结果表明miRNA 24-3p不能促使角膜上皮细胞增殖，但可以提高角膜上皮细胞趋化性并促使角膜上皮细胞迁移。在体外细胞伤口闭合实验中，miRNA 24-3p组完成了50%以上的伤口闭合面积，而阴性对照miRNA NC组无细胞伤口闭合。miRNA 24-3p还可以上调迁移相关基因FRS2、CDC42、CTGF、EGFR和MMP9的表达，与空白对照组和阴性对照组相比都具有显著性差异。<br>　　其次，为解决miRNA 24-3p自身无法直接进入细胞的问题，我们提出利用脂肪间充质干细胞源外泌体被作为miRNA 24-3p的外载体，携带miRNA 24-3p进入角膜上皮细胞产生作用。通过使用梯度超速离心法从脂肪间充质干细胞中提取外泌体，并对脂肪间充质干细胞和外泌体进行鉴定，外泌体符合外泌体评判的“金标准”。用不同浓度的外泌体处理角膜上皮细胞，细胞增殖、细胞趋化性、细胞迁移以及vinculin蛋白表达等实验结果表明细胞对外泌体具有浓度依赖性，随着外泌体浓度的增加，角膜上皮细胞的增殖能力、细胞趋化性、细胞迁移能力增强，vinculin 蛋白表达增多，迁移相关基因的表达量增加。因此，在角膜上皮缺损愈合过程中，外泌体本身也具有促进细胞增殖、细胞黏附和细胞迁移的能力。接着，我们通过使用电穿孔的方式制备富含 miRNA 24-3p 外泌体。在体内兔角膜上皮缺损疾病动物实验治疗中，采用结膜下注射富含miRNA 24-3p外泌体，通过治疗后12天的观察，相比单独的外泌体组（85%），富含miRNA 24-3p外泌体实验组在术后第2天可加速兔角膜上皮创伤伤口快速闭合，愈合率超过90%以上，同时术后7天调控角膜上皮厚度（25–30 μm）和层数（3–4层）接近于天然角膜，术后12天上调CK3、ZO-1、EGFR和MMP9表达，调控角膜上皮成熟，促使角膜组织修复。<br>　　由于结膜下给药方式会破坏结膜组织带来新的创伤，我们进一步改进miRNA 24-3p的递送载体，提出通过构建多级递送系统提高富含miRNA 24-3p外泌体在眼表的生物利用度。基于透明质酸的润滑作用和保湿优势，我们使用温敏性单体材料DEGMA对透明质酸进行修饰，成功制备的温敏性透明质酸水凝胶在眼表滴注后可形成一层弱水凝胶。透明质酸水凝胶的孔径随着它的浓度增加而减小，呈管状网络结构。其中浓度为3 wt%透明质酸水凝胶的临界温度为37℃，具有剪切变稀性、可注射性、稳定性。浓度为3 wt%透明质酸水凝胶在兔眼表可行成一层与眼表一致的高度均匀、透明的薄层，可用于延长富含miRNA 24-3p外泌体在眼表的截留时间。在水凝胶的眼用安全性评估中，与天然结膜组相比，浓度为3 wt%透明质酸水凝胶组结膜无多核细胞形成以及炎症细胞浸润，具有大量结膜特有的杯状细胞，展现了良好的眼用安全性。基于富含miRNA 24-3p外泌体的生物学功能和透明质酸水凝胶的温敏性，负载富含 miRNA 24-3p 外泌体于浓度为 3 wt%透明质酸水凝胶中，制备得到miRNA 24-3p多级递送系统。浓度为3 wt%透明质酸水凝胶释放外泌体可长达 21 天以上，并且浓度为 3 wt%透明质酸水凝胶释放的富含miRNA 24-3p外泌体能成功进入角膜上皮细胞。兔角膜碱烧伤疾病动物模型治疗中，相比其他组，miRNA 24-3p多级递送系统组加速碱烧伤角膜上皮愈合速率最快，治疗1天后上皮闭合面积超过87%。同时，在兔角膜碱烧伤疾病动物模型治疗28天后，miRNA 24-3p 多级递送系统减轻角膜水肿，调控角膜上皮成熟，抑制角膜基质纤维化和巨噬细胞活化，调控碱烧伤角膜组织微环境，促使角膜组织修复。<br>　　因此，基于外泌体和温敏性透明质酸水凝胶构建的miRNA 24-3p多级递送系统有望用于解决角膜上皮损伤愈合问题，为角膜上皮缺损治疗提供了一种基因疗法与无细胞疗法联合治疗的新方法和思路。