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摘要研究背景：<br>　　冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病），是全球高发病率和高死亡率的心血管疾病之一。冠心病，指在冠状动脉内由氧化脂质形成动脉粥样硬化斑块，引起动脉狭窄和阻塞，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病。纠正血脂异常是预防和逆转动脉粥样硬化，并降低冠心病发病率和死亡率的公认防治目标。尽管目前治疗手段已经取得很大的进步，冠心病的发病率和死亡率仍呈逐年上升的趋势。因此，目前对于血脂异常和冠心病的控制率和治疗率仍有待提高，加强防治工作刻不容缓。<br>　　肠道菌群研究为心血管疾病的预防或治疗提供了新机遇。肠道菌群可能直接或间接调控宿主脂质代谢、免疫和冠心病的发生发展。据我们前期的宏基因组学研究报道，冠心病患者中Bacteroidescellulosilyticus、Faecalibacteriumprausnitzii和Roseburiaintestinalis显著缺乏。有研究发现在绝经后的妇女中B.cellulosilyticus和F.prausnitzii与健康的血脂谱有关。但目前对B.cellulosilyticus在疾病中的作用认识仍较少。有研究表明补充F.prausnitzii可改善高脂喂养小鼠的肝脏健康，但它在动脉粥样硬化中的作用尚不清楚。有研究报道R.intestinalis结合高纤维饮食治疗，可减少以产丁酸盐的八种核心群落特异性接种的无菌小鼠模型的动脉粥样硬化斑块。然而，目前尚无证据说明单独补充R.intestinalis改善动脉粥样硬化的作用，以及它除产丁酸外其它可能的分子机制。此外，有研究报道拟杆菌对F.prausnitzii的生长有促进作用，而联合补充拟杆菌门和厚壁菌门的成员是否疗效更佳尚未报道。因此，在动脉粥样硬化模型小鼠中探索这些候选肠道菌及其组合是否可有效预防和/或治疗血脂异常和动脉粥样硬化具有重要的临床意义。<br>　　代谢物是肠道细菌调节宿主代谢平衡和心血管疾病发生发展的重要信使。这三种候选肠道菌可通过产生短链脂肪酸发挥作用。然而，不同疾病条件或肠道菌群作用下，许多循环中的肠道菌群依赖性代谢物仍然是未知的。肠道菌群还可通过调节胆汁酸信号通路参与调控冠心病的发病机理，如通过调节胆汁酸比例激活法尼醇X受体（FXR），从而调节肝脏脂质代谢影响冠心病发生发展。因此，进一步依托测序技术和多组学研究方法的进步，立足于特定疾病环境和组织，针对性地在不同层次的分子水平上揭示候选菌株干预引起的宿主-微生物-代谢物-基因表达水平调控网络的变化，更有利于扩展我们对肠道菌群在冠心病中的作用机制的认识。<br>　　本研究是结合临床数据与动物实验的综合性研究，首先利用人群队列确证B.cellulosilyticus、F.prausnitzii和R.intestinalis与冠心病发生以及血脂等的关系，并利用Apoe-/-小鼠模型验证单独或联合补充三种候选肠道菌株改善血脂和动脉粥样硬化病变的作用；然后结合肝脏转录组学和血浆广泛靶向代谢组学分析提示补充候选肠道菌株改善Apoe-/-小鼠脂代谢平衡和动脉粥样硬化可能调控的代谢物和信号通路；进一步通过宏基因组测序揭示补充候选菌株是否通过调节肠道菌群分布而发挥降脂的作用，并探究冠心病人群中三种候选肠道细菌改善临床预后的作用。从而加深肠道菌群-代谢物-宿主之间复杂调控网络的认识，为阐明三种候选肠道细菌发挥心血管保护作用的潜在作用机制提供新证据，有望为冠心病的防治提供潜在的生物标志物和新方法。<br>　　第一章人群队列和Apoe-/-小鼠中证实三种候选肠道菌改善血脂抗动脉粥样硬化的作用<br>　　目的：<br>　　1.在人群队列中阐明候选肠道菌B.cellulosilyticus、F.prausnitzii和R.intestinalis对冠心病发生和血脂等心血管代谢性因素的影响。<br>　　2.在动物模型中阐明单独或联合补充三株候选菌株改善Apoe-/-小鼠血脂水平抗动脉粥样硬化的作用。<br>　　方法：<br>　　1.采用R软件对218例冠心病和187例健康人的宏基因组数据进行重分析，Wilcoxon秩和检验比较两组间B.cellulosilyticus、F.prausnitzii和R.intestinalis相对丰度的差异。<br>　　2.利用2183名成年健康个体的宏基因组测序数据分析肠道菌群与血脂等心血管代谢因素的相关性。<br>　　3.将从年轻的健康个体中分离出的三株细菌（B.cellulosilyticusAF17-25、F.longumCM04-06和R.intestinalisAM43-11）单独或联合给予高脂喂养的Apoe-/-小鼠灌胃约18周。分组：正常高脂对照组、Apoe-/-模型对照组、B.cellulosilyticus组、F.longum组、R.intestinalis组、B,F,R联合组。<br>　　4.自动化学分析仪测定小鼠干预后血浆中血糖（Glucose,GLUC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-densitylipoproteincholesterol，LDLC）、总胆固醇（Cholesterol，CHOL）、高密度脂蛋白胆固醇（High-densitylipoproteincholesterol，HDLC）的水平。<br>　　5.主动脉大体横切面内膜油红O染色和主动脉根部横截面冰冻切片的油红O、Masson和HE染色评估小鼠动脉粥样硬化病变情况，小动物心脏B超评价小鼠的心脏结构和功能。<br>　　结果：<br>　　1.与健康个体相比，B.cellulosilyticus（P=6.06×10-3）、F.prausnitzii（P=8.83×10-5）和R.intestinalis（P=1.17×10-4）在冠心病患者中显著降低。<br>　　2.在健康个体中，B.cellulosilyticus与血清TG水平和腰臀比呈负相关，而与HDLC呈正相关，F.prausnitzii与TG、CHOL和LDLC水平以及体脂肪比例呈负相关，R.intestinalis则与腰臀比和体脂肪呈负相关（FDR＜0.05）。<br>　　3.与Vehicle干预的Apoe-/-对照组小鼠相比（P＜0.05），B.cellulosilyticus组小鼠的GLUC、TG和LDLC显著降低，F.longum组小鼠的TG和LDLC显著降低，R.intestinalis组小鼠的TG降低而HDLC升高，而B,F,R联合组小鼠的GLUC和LDLC水平显著降低。<br>　　4.与Vehicle干预的Apoe-/-对照组小鼠相比（P＜0.05），主动脉大体内膜油红O染色显示B.cellulosilyticus和B,F,R联合组小鼠的主动脉内膜的脂质堆积显著减少；主动脉根部横切面的油红O和HE染色显示，B.cellulosilyticus和B,F,R联合组小鼠主动脉的脂质沉积和主动脉粥样硬化斑块形成显著减少；Masson染色显示，R.intestinalis和B,F,R联合组小鼠主动脉的胶原沉积显著降低；心脏B超显示B,F,R联合组小鼠的左室射血分数和缩短分数显著增高。<br>　　结论：<br>　　人体中B.cellulosilyticus，F.prausnitzii和R.intestinalis的缺乏与冠心病的发生和不健康的脂质代谢参数有关，补充候选菌株（B.cellulosilyticusAF17-25、F.longumCM04-06和R.intestinalisAM43-11），特别是单独补充B.cellulosilyticus和联合补充三株菌，对动脉粥样硬化模型小鼠血脂失衡和（或）脉粥样硬化病变有较好的缓解作用，而菌株联合补充还对小鼠心功能有适当的保护作用。这将为它们作为潜在的脂质失衡和（或）动脉粥样硬化防治的益生菌及干预靶标提供重要证据。<br>　　第二章候选肠道菌株干预对Apoe-/-小鼠肝脏转录组和血浆广泛靶向代谢组的影响<br>　　目的：<br>　　探讨候选菌株干预调控的重要信号分子及关键代谢物，以加深对脂代谢失衡和动脉粥样硬化过程中所涉及的宿主-微生物-代谢物调控网络的了解，为阐明候选菌株发挥心血管保护作用的分子机制提供重要见解。<br>　　方法：<br>　　1.以第一章中Apoe-/-小鼠干预后分离的肝脏组织为研究对象，采用转录组测序对肝脏进行基因表达水平的检测，“clusterProfiler”包进行GeneOntology（GO）富集分析，“edgeR”包分析候选菌株干预后的差异表达基因。<br>　　2.以第一章中Apoe-/-小鼠干预后采集的血浆样本为研究对象，采用广泛靶向代谢组学对血浆中的内源性代谢物进行检测，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）法和t检验分析候选菌株干预后的差异代谢物。<br>　　结果：<br>　　1.GO富集分析显示，与Apoe-/-对照组相比，B.cellulosilyticus、F.longum和R.intestinalis单独及联合干预组小鼠，脂质合成与代谢通路基因显著下调，而昼夜节律相关通路基因显著上调。<br>　　2.肝脏转录组的差异表达基因分析显示，与Apoe-/-对照组相比，候选菌株干预可显著调节Apoe-/-小鼠脂质合成与代谢相关基因的表达，主要包括降低的胆固醇（如Hmgc1、Pmvk和Dhcr7）、脂肪酸（如Acc、Fasn、Acly和Elovl6）和TG合成（如Agpat2）基因，增加的TG和脂肪酸分解（如Pnpla2、Cpt1a）以及胆汁酸合成（如Cyp8b1、Cyp7a1）基因表达；候选菌株干预还可激活核受体（如Rev-erb、Ppparα、Fxr、Nr4a1）和昼夜节律基因（Rev-erb、Dbp、Ciart、Per3）的表达促进脂质代谢平衡。<br>　　3.广泛靶向代谢组学分析显示，与Apoe-/-对照组相比，候选菌株的补充伴随着血浆中石胆酸、3-羟基-3-甲基丁酸、吲哚乙酸、黄嘌呤核苷等代谢物水平升高，20,26-二羟基蜕皮酮、甘油磷脂和游离脂肪酸等降低，这些差异代谢物的变化与健康的脂质平衡显著相关。<br>　　结论：<br>　　1.B.cellulosilyticus、F.longum和R.intestinalis及其联合补充可能通过抑制肝脏中脂肪酸、TG和胆固醇生成和促进脂肪酸、TG分解以及胆汁酸形成相关基因的表达改善动脉粥样硬化模型小鼠的血脂失衡，进而预防动脉粥样硬化的形成。<br>　　2.候选菌株干预还可能通过调节宿主血浆代谢物水平，如升高石胆酸和3-羟基-3-甲基丁酸和降低20,26-二羟基蜕皮酮和甘油磷脂，从而促进血脂平衡。<br>　　3.候选菌株补充一方面可能通过上调肝脏Rev-erb、Dbp、Ciart和Per3等昼夜节律基因调控脂质代谢通路平衡；另一方面可能通过石胆酸激活核受体基因FXR和Pparɑ调控脂质代谢，从而改善高脂饮食诱导的脂代谢失衡和（或）动脉粥样硬化。<br>　　第三章候选肠道菌株干预改变Apoe-/-小鼠肠道菌群分布及对血脂的影响<br>　　目的：<br>　　观察候选菌株干预后在小鼠肠道菌群中的定植情况及各类肠道微生物的分布变化，揭示候选菌株干预所导致的肠道菌群分布差异对宿主血脂和血浆代谢物水平的影响，解析各组小鼠对关键微生物源性代谢产物的合成与代谢的潜在功能。<br>　　方法：<br>　　1.采用BGISEQ-500平台的Shotgun宏基因组测序方法对各组Apoe-/-小鼠在干预前和干预期间第6-25周龄时的粪便肠道菌群进行定量分析，PerMANOVA检验比较组间干预前和干预结束后微生物组成差异，DMM聚类模型分析各组小鼠肠道微生物组的发育和整体结构。<br>　　2.采用线性回归分析小鼠经候选菌株干预后25周龄时血脂水平与肠道菌群相对丰度之间的相关性，以及候选菌株干预对干预后肠道菌群的相对丰度以及干预期间肠道菌群生长速度的影响。<br>　　3.宏基因组测序数据的功能注释分析解析经候选菌株干预后25周龄时各组小鼠生成石胆酸（Lithocholicacid，LCA）的7α-脱羟基途径、短链脂肪酸（Short-chainfattyacids，SCFA）和支链氨基酸（Branchedchainaminoacid，BCAA）合成与代谢途径的代谢功能变化。<br>　　4.采用线性回归分析候选菌株干预后小鼠粪便肠道菌群相对丰度与血浆代谢物水平的相关性。<br>　　结果：<br>　　1.干预结束后各组小鼠的肠道微生物组成具有显著差异（R2=0.285，P=1×10-4），B.cellulosilyticus和F.longum组对应的菌群丰度显著增加，R.intestinalis组对应的菌群相对丰度略有升高，联合组的小鼠仅B.cellulosilyticus和R.intestinalis丰度显著增加。DMM聚类分析显示各组菌株干预差异性地影响小鼠肠道微生物组的发育和整体结构。<br>　　2.有11种与血脂水平相关的菌群（FDR＜0.05），7种为负相关类群，包括Lactobacillus属（如L.johnsonii和L.taiwanensis）、Bacteroides门（Bacteroidescaecimuris、B.cellulosilyticus和Alistipesinops）、Bilophilawadsworthia和Staphylococcusnepalensis；4种为正相关类群，包括Olsenellaprofuse、Bordetellapseudohinzii,Oscillibactersp13和Turicimonasmuris。候选菌株干预后小鼠肠道微生物区系中与LDLC负相关的分类群的相对丰度和生长速度显著高于Apoe-/-对照小鼠，而与LDLC正相关的分类群则在菌株干预组降低。<br>　　3.上述11种脂类相关类群的相对丰度与69个血浆代谢物的水平显著相关，包括Lysopc、Lysope、肉碱、LCA、BCAA和20,26-二羟基蜕皮酮等。<br>　　4.宏基因组的功能注释分析显示，与Apoe-/-对照组相比，候选菌株干预组小鼠肠道中BCAA合成途径异亮氨酸合成降低，而BCAA分解代谢途径磷酸泛酸生物合成I和谷氨酸合成四吡咯途径则显著升高；SCFA合成与代谢途径丙酮酸发酵成丙酸I、植酸降解成丁酸增加。<br>　　5.候选菌株干预后，小鼠粪便LCA水平与LCA合成的7α-脱羟基途径的bai操纵子转录丰度呈正相关，与Apoe-/-对照组相比，菌株干预后bai转录丰度总体上呈升高趋势，其中bai基因丰度较高的肠道菌群包括Lachnospiraceaebacterium、Olsenellaprofuse、Roseburiaintestinalis、Faecalibacteriumprausnitzii、Eubacteriumplexicaudatum等。<br>　　结论：<br>　　1.B.cellulosilyticus、F.longum和R.intestinalis及其联合干预可有利地重塑Apoe-/-小鼠的肠道微生物群的物种平衡，提示候选菌株干预的作用是依赖于肠道菌群之间复杂的互作网络而赋予宿主健康益处的。<br>　　2.候选菌株干预可将Apoe-/-小鼠中以脂类正相关类群为主的群落（如Aerococcusviridans、Olsenellaprofuse）过渡到脂类负相关类群，包括Lactobacillus（如L.taiwanensis,L.johnsonii）、Bacteroides（如Alistipesinops、B.caecimuris、B.cellulosilyticus）等，这种变化有利于降低宿主血脂水平并减缓主动脉脂质沉积。<br>　　3.干预后的肠道菌群结构可进一步通过调节宿主体内血浆代谢物水平，以及肠道菌群代谢功能的变化，包括增加SCFA和降低BCAA的生成，以及增加肠道菌群中bai的转录丰度促进LCA的生成，发挥心血管保护作用。<br>　　第四章三种候选肠道菌群对冠心病患者临床预后的影响<br>　　目的：<br>　　在已有冠心病的患者中，探索候选肠道菌B.cellulosilyticus、F.prausnitzii和R.intestinalis可通过调控哪些心血管代谢性因素发挥对患者的保护作用，并最终降低临床终点事件的发生风险。<br>　　方法：<br>　　1.前瞻性地入选冠心病患者，收集患者入院时血脂、血糖、血压、心衰、心肌梗死和免疫炎症等相关的心血管代谢性因素的检测指标，定期随访患者出院后是否发生死亡和主要不良心血管事件（Majoradversecardiovascularevent,MACE）。<br>　　2.BGISEQ-500宏基因组测序平台检测患者粪便中B.cellulosilyticus、F.prausnitzii和R.intestinalis的组成和相对丰度。<br>　　3.利用R软件，线性回归分析候选肠道菌群的相对丰度与心血管代谢性因素指标的相关性，Cox回归模型评估肠道菌群的相对丰度对死亡和MACE发生风险的影响。<br>　　结果：<br>　　1.线性回归分析显示（P＜0.05），冠心病患者中F.prausnitzii和R.intestinalis丰度与心衰指标B型钠尿肽前体proBNP和高敏肌钙蛋白hs-TnT以及炎症相关指标纤维蛋白原FIB均呈负相关，与血清游离三碘甲状腺原氨酸FT3则呈正相关。R.intestinalis与糖化血红蛋白HbA1c和炎症指标C反应蛋白CRP和中性粒细胞计数NEUT呈负相关。<br>　　2.Cox回归分析显示，冠心病患者中F.prausnitzii（HR[95%CI]：0.80[0.74-0.88]，P=0.0067）和R.intestinalis（HR[95%CI]：0.74[0.67-0.86]，P=0.0006）均与降低的死亡风险相关。F.prausnitzii还与降低的MACE风险显著相关（HR[95%CI]：0.84[0.76-0.91]，P=0.0004）。<br>　　结论：<br>　　F.prausnitzii和R.intestinalis在冠心病患者中具有降低心衰及临床终点事件发生风险的潜在益处，结果还进一步支持了R.intestinalis降低患者血糖和炎症的可能性。这为拓展它们应用于冠心病的二级预防提供了新方向和理论依据。<br>　　综上所述，本研究中人群队列和动物模型的结果均一致的证实了单独或联合补充B.cellulosilyticus、F.prausnitzii和R.intestinalis在减轻脂质失衡和（或）动脉粥样硬化方面的有效性。本研究还为揭示候选菌株干预改善脂代谢失衡所涉及的微生物-代谢物-宿主脂质代谢基因调控网络提供了新见解，为阐明候选菌株发挥心血管保护作用的潜在机制提供了重要的新证据。因此，本研究结果将为候选肠道菌作为脂质失衡和动脉粥样硬化防治的益生菌或干预靶点提供重要的理论支撑，并有望将F.prausnitzii和R.intestinali的作用拓展至改善冠心病患者临床预后。