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摘要酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755）是一种严格厌氧，产芽孢的非致病微生物，因其具有较高的丁酸、丁醇产量和选择性，被广泛应用于廉价生物质发酵的研究。同时，作为一种益生菌，酪丁酸梭菌还可用于动物养殖方面，具有改善动物肠道健康、增加动物体重、降低料肉比及减少抗生素污染等优点。在某些条件下，可以形成抗逆性极强的芽孢以抵抗不良环境，增加菌株存活率。然而C. tyrobutyricum菌株芽孢产率较低，鲜有研究报道该菌株芽孢形成机制。本研究拟通过研究spo0A基因及sigma因子阐明C. tyrobutyricum的产孢机制，优化产孢培养基及培养条件以提高菌株的芽孢水平和产孢率，最后寻找能够提高菌株产孢能力的基因，在分子水平改造以进一步提高菌株产孢水平。<br>　　本研究首先对C. tyrobutyricum菌株产孢关键基因spo0A及4个sigma因子进行探究。敲除spo0A后菌株丧失产孢能力，并且芽孢形成基因表达水平显著降低。然而在过表达spo0A基因后，菌株产孢水平降低为野生型菌株2%，菌体形态发生明显改变，sigma因子表达水平降低。分别敲除σF、σE、σG及σK后，菌株均不产芽孢。sigK基因敲除显著降低了spo0A基因转录水平，同时sigF、sigE、sigG基因转录水平菌下调。说明在C. tyrobutyricum产孢机制中，SigK通过影响spo0A基因转录在产孢前期具有重要作用。<br>　　对产孢水平、芽孢耐热性能及萌发性能进行评估，选定梭菌生长强化培养基（RCM）为C. tyrobutyricum产孢培养基，菌株在培养第3天时，芽孢水平最高，可达9.3×104 CFU/mL。对培养基成分及培养条件进行优化，以10 g/L木糖为氮源、10 g/L鱼粉为氮源、培养条件为35℃，出发pH为5，转速150 rpm，接种量1.5% v/v培养时，菌体芽孢可达7.61×107CFU/mL。进一步在5 L发酵罐中进行扩大培养，以40 g/L木糖为碳源培养3天，菌株产孢量达到3.58×108 CFU/mL，同时产孢率高达95.6%。<br>　　为了进一步提高C. tyrobutyricum的产孢水平，分析并鉴定了全局调控因子AbrB （Antibiotic resistance protein B）对菌株产孢及其他方面的调控作用。AbrB一方面调节spo0A基因和sigma因子的转录直接调控产孢过程。另一方面还通过调控参与脂肪酸合成途径fab操纵子间接影响产孢过程。敲除abrB基因后，突变株（Ct/ΔabrB）产孢水平较野生菌提高3.4倍，达到3.19×105 CFU/mL；同时生物膜合成水平显著降低，影响菌株对低 pH、高渗透压和产物浓度的耐受性。与原始菌株相比，Ct/ΔabrB 菌株利用木糖和甘露糖能力显著降低，糖秏能力分别降低22.33%和29.04%，而对葡萄糖和果糖的代谢没有显著影响。在葡萄糖/木糖混糖发酵中，Ct/ΔabrB缓解了菌株碳代谢阻遏现象，提高了菌株对木糖的代谢能力，显著提高了菌株的丁酸产量（13.11 g/L vs. 7.00 g/L）。在葡萄糖/甘露糖混糖发酵中，abrB 基因缺失强化了菌株的乙酸重新收能力，与野生菌株相比，突变株丁酸产量提高了12.61%。<br>　　综上所述，本研究探究了C. tyrobutyricum ATCC 25755产孢关键基因spo0A及sigma因子对芽孢形成影响，鉴定并探究产孢调节因子AbrB对菌株产孢的作用，完善和丰富了酪丁酸梭菌产孢及其调控机制。同时通过培养基优化及培养条件优化，使得菌株产孢水平较优化前提高了3.8×104倍，且明显降低产孢成本，为酪丁酸梭菌大规模制备益生菌制剂提供技术支持。