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摘要目的：<br>　　本研究旨在探讨牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis）感染与食管鳞状细胞癌（EsophagealSquamousCellCarcinoma，ESCC）自噬流发生发展的相关性。通过临床样本检测，体外细胞及体内动物实验阐述P.gingivalis可通过干预ESCC细胞中SNARE蛋白复合物聚合导致自噬体与溶酶体融合受阻，最终引起P.gingivalis发生自噬逃逸从而长期定植于ESCC细胞并促进食管鳞癌恶性进展的整体系统机制，为食管鳞癌病因学研究和临床防治策略的制定提供新的科学依据。<br>　　方法：<br>　　1.采用免疫组织化学法（Immunohistochemistry，IHC）检测179例食管鳞状细胞癌患者石蜡包埋的癌及相应癌旁组织中P.gingivalis感染及自噬相关蛋白p62的表达情况，并分析P.gingivalis与自噬相关蛋白SQSTM1/p62之间的潜在作用机制，及其与临床病理特征、5年生存预后的相关性。<br>　　2.通过透射电子显微镜（Transmissionelectronmicroscopy）及免疫荧光法（Immunofluorescence，IF）检测P.gingivalis感染对食管鳞癌细胞自噬流的影响。在ESCC细胞中，利用单丹磺酰尸胺（Dansylcadaverine，MDC）染料标记自噬体，溶酶体红色荧光探针（Lysotracker-Red）标记溶酶体，并以自噬抑制剂三甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）及氯喹（Chloroquine，CQ）作为对照。<br>　　3.利用自噬双标腺病毒GFP-RFP-LC3标记P.gingivalis感染后的ESCC细胞通过共聚焦显微镜对单个活细胞的荧光变化进行实时动态监测，以分析P.gingivalis感染不同时间对食管鳞癌细胞自噬流的影响。<br>　　4.通过免疫印迹法（Western-blot）及免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）检测P.gingivalis感染对食管鳞癌细胞中自噬相关蛋白LC3、p62以及Beclin1表达量的影响及其与SNARE相关蛋白（SNAP29、VAMP8及STX17）间的互作情况，进一步探索P.gingivalis在食管鳞癌细胞中调节自噬流的具体机制。<br>　　5.采用菌斑测定法（PlaqueAssay）检测自噬启动基因ATG7及SNARE蛋白复合物对P.gingivalis在食管鳞癌细胞中定植率的影响。<br>　　6.连续21天对C57小鼠口腔灌注P.gingivalis并将各组小鼠分为自噬抑制剂3-MA及CQ单药处理组及3-MA+CQ联合处理组，随后通过RNAScope法及Taqman-qPCR法检测C57小鼠食管黏膜载菌量，进一步验证自噬对P.gingivalis在食管黏膜定植率的影响。<br>　　7.收集P.gingivalis感染阳性的食管鳞癌患者经手术切除后的肿瘤标本，荷在BALB/cnude裸鼠皮下构建食管鳞癌PatientDerivedXenograft（PDX）小鼠模型，并分为化疗药紫杉醇（Paclitaxel）单药处理组、自噬抑制剂3-MA处理组以及3MA+Paclitaxel联合处理组，利用Western-Blot检测各组瘤体凋亡水平以分析自噬活性对P.gingivalis阳性的食管鳞癌患者化疗敏感性的影响，随后通过体外细胞实验再次验证自噬抑制剂3-MA对P.gingivalis感染后的食管鳞癌细胞化疗敏感性的影响。<br>　　8.统计学分析：统计分析均采用SPSS26.0软件。计数资料一致性分析采用Cohen’skappa分析，相关性分析采用?2检验；计量资料以均数±标准差(x?s)表示，两组以上组间差异比较采用单因素方差分析。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank法分析各组生存时间的差异，Cox回归分析（单因素及多因素回归分析）用于筛选独立危险因素。生存时间为病理诊断为食管鳞状细胞癌日期至死亡或最后1次随访日期；随访周期为5年（60个月）；删失数据为存活满5年的患者，未删失数据为由ESCC疾病进展而引起死亡的患者。P＜0.05为差异有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　1.在179例ESCC患者癌及癌旁组织中通过免疫组织化学法检测P.gingivalis感染及自噬蛋白p62表达情况，结果显示：在ESCC组织中，P.gingivalis感染及p62表达均高于相应癌旁组织，且二者呈显著正相关。P.gingivalis感染且p62高表达的ESCC患者往往伴随长期烟酒史、临床分期晚、分化程度低、淋巴结转移早和5年生存率较低等不良指标。<br>　　2.透射电子显微镜结果显示：经P.gingivalis感染后，ESCC细胞质中产生大量自噬体，证实P.gingivalis感染能够引起ESCC细胞发生自噬；随后通过共聚焦显微镜进一步检测P.gingivalis感染对ESCC细胞自噬水平的影响，结果显示在P.gingivalis感染6h时，MDC与Lysotracker-Red共定位量显著多于P.gingivalis感染24h，且通过与自噬抑制剂3-MA和CQ作对比，初步证实P.gingivalis感染可引起ESCC细胞发生自噬，并随着其持续感染能够干预ESCC细胞自噬进程。<br>　　3.通过共聚焦显微镜实时动态监测经自噬双标腺病毒GFP-RFP-LC3标记的单个ESCC细胞在P.gingivalis感染后的荧光水平变化，结果显示：在P.gingivalis感染初期（1-12h）能够引起自噬的发生且自噬活性较高，而随着P.gingivalis持续感染（12-24h），自噬体与溶酶体融合量也持续减少，引起细胞质中大量自噬体累积，导致自噬流受阻。<br>　　4.Western-blot结果显示：随着P.gingivalis持续感染，ESCC细胞中自噬相关蛋白LC3和p62表达量逐渐升高同时伴随着Beclin1蛋白表达水平逐渐降低，与临床样本及免疫荧光检测结果一致；而Co-IP结果则进一步证实P.gingivalis可通过干预SNARE复合物中SNAP29、VAMP8及STX17之间的互作而阻断SNARE复合物形成，导致ESCC细胞自噬流受阻。<br>　　5.通过构建自噬启动基因ATG7及SNARE复合物中SNAP29基因缺失的ESCC细胞检测P.gingivalis在ESCC细胞中的定植率。PlaqueAssay实验结果显示，与对照组及ATG7敲降组相比，SNAP29基因的敲降更有利于P.gingivalis在ESCC细胞中定植。<br>　　6.采用RNAScope法及Taqman-qPCR法检测C57小鼠食管黏膜载菌量，结果显示3-MA抑制剂能够显著抑制P.gingivalis在小鼠食管黏膜的定植；而与3-MA及3-MA+CQ联合处理相比，CQ抑制剂处理组P.gingivalis在小鼠食管黏膜定植量显著升高。<br>　　7.收集P.gingivalis感染阳性的食管癌患者肿瘤建立PDX动物模型并利用Paclitaxel及3-MA干预，结果显示：与Paclitaxel单药处理组及3-MA处理组相比，3MA+Paclitaxel联合处理组小鼠瘤体体积最小、重量最轻且凋亡水平最高，在体外细胞实验中也再次得到验证。有效调节自噬活性可能是提高P.gingivalis感染阳性的食管癌患者化疗敏感性的重要手段。<br>　　结论：<br>　　P.gingivalis感染与ESCC的发生发展密切相关，本研究首次从自噬的角度展开P.gingivalis在ESCC中致病机制的研究。探明P.gingivalis可通过干预SNARE复合物聚合，诱发自噬逃逸而协助其在ESCC细胞中长期定植。进一步通过PDX动物实验证实有效调节自噬活性能够提高P.gingivalis阳性的ESCC患者对化疗药物的敏感性，为食管鳞癌病因学研究和临床防治策略的制定提供新的科学依据。