环境响应性多孔药物载体的构建及其在肿瘤诊疗中的应用-论文-万方医学网

环境响应性多孔药物载体的构建及其在肿瘤诊疗中的应用

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摘要研究背景： 　　肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，目前临床上治疗肿瘤的方法有手术切除，放疗，化疗，免疫治疗等，其中化疗是肿瘤治疗的主要方法，虽然化疗能有效杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长，但是化疗药物缺乏靶向传递性，给人体带来了不可避免的毒副作用，如：损伤免疫系统、脏器病变、胃肠道反应及骨髓抑制等，从而导致化疗失败。 　　采用药物载体可有效提高化疗药物在肿瘤组织的募集，减少对机体的损伤。在众多药物载体中，多孔药物载体具有较大比表面积、孔径可调、较高药物装载量、良好生物相容性等优势，可用于化疗药物的装载，运输及释放。尽管多孔药物载体装载的化疗药物能有效缓解药物对机体的副作用，但是在体内运输过程中，多孔药物载体存在易被机体免疫系统清除，易被机体组织非特异性吸附及释放效果不佳等缺陷，导致药物在肿瘤组织聚集量减少，严重削弱了药物的治疗效果并产生一系列不良后果。 　　为解决以上问题，本论文利用多孔硅、金属有机框架材料为药物载体，构建了生物模拟膜修饰的靶向多孔药物载体，实现药物在肿瘤组织的靶向递送并避免机体免疫系统对其清除，同时利用特殊的肿瘤微环境，在动物水平实现了药物在肿瘤部位的精准释放和多模态诊疗。 　　研究目的： 　　利用多孔材料较大比表面积和较高药物装载量等特点，本论文设计了两种以铁为基质的环境响应性多孔药物载体，旨在实现药物靶向募集，环境控制精准释放，改善肿瘤微环境，实现肿瘤治疗的级联效应，并增加生物相容性的目标。 　　第一章:透明质酸修饰的二氧化硅包覆Fe3O4纳米颗粒靶向给药 　　研究方法： 　　1.Fe3O4-MS-HANPs的构建及其生物学评价 　　以二氧化硅和Fe3O4为基本材料，制备具有磁响应性能的二氧化硅包覆Fe3O4纳米颗粒（Silica-coatedFe3O4nanoparticles，Fe3O4-MSNPs），通过Fe3O4-MSNPs表面的氨基与透明质酸（Hyaluronicacid,HA）羧基之间的共价偶联，制备透明质酸修饰的二氧化硅包覆Fe3O4纳米颗粒（Hyaluronicacid-modifiedmesoporoussilica-coatedFe3O4nanoparticles，Fe3O4-MS-HANPs）。利用透射电镜（Transmissioneletronmicroscope，TEM），傅里叶红外光谱（Fouriertransforminfraredspectroscopy，FTIR），X射线光电子能谱（X-rayphotoelectronspectroscopy，XPS），氮气物理吸附（N2absorption-desorptioninstrument，BET）表征Fe3O4-MS-HANPs的基本结构；通过细胞增殖实验验证其生物相容性。 　　2.Fe3O4-MS-HANPs生物学功能 　　Fe3O4-MS-HANPs浸入到体外模拟高浓度过氧化氢（Hydrogenperoxide，H2O2）溶液中，通过溶解氧检测仪，检测Fe3O4-MS-HANPs悬浊液中的氧气含量；并将其与4T1细胞共孵育，通过荧光显微镜观察肿瘤细胞内氧探针三（4，7-联苯-1，10-邻菲啰啉）二氯化钌（RDPP）荧光信号强度，评估细胞内氧含量。3.HA-MSNsNPs的药物装载释放及体外协同治疗 　　Fe3O4-MS-HANPs与抗肿瘤药物阿霉素（Doxorubicin，DOX）混合，DOX成功装载到Fe3O4-MS-HANPs上（Fe3O4-MS/DOX-HANPs），利用DOX装载前后荧光信号的变化，验证Fe3O4-MS-HANPs的载药能力。Fe3O4-MS/DOX-HANPs浸入到体外模拟偏酸的溶液中（pH=5.5）通过检测DOX的荧光信号，评估DOX的释放效果；将Fe3O4-MS/DOXNPs和Fe3O4-MS/DOX-HANPs分别与4T1细胞和GES-1细胞共孵育，评估4T1细胞和GES-1细胞分别对Fe3O4-MS/DOXNPs和Fe3O4-MS/DOX-HANPs的摄取，通过细胞增殖实验验证Fe3O4-MS/DOXNPs和Fe3O4-MS/DOX-HANPs对4T1细胞和GES-1细胞的抑制效果。 　　4.小鼠皮下移植瘤模型的构建 　　将培养好的4T1细胞用胰酶消化，并用PBS清洗3遍，将得到的4T1细胞用PBS重悬，并均匀混合；取出Balb/c小鼠并固定好，用75％酒精擦拭小鼠右下侧乳腺处，用1mL注射器吸取200μL4T1（1×107）细胞悬液，注射到小鼠右下侧乳腺皮下，停留30s，将针头旋转退出；每天观察Balb/c小鼠移植瘤生长情况，7d后接种部位触摸到或肉眼可见小鼠皮下瘤，每3d称取小鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤组织长边和短边直径（mm）并根据相关公式计算出小鼠肿瘤体积大小（mm3），小鼠移植瘤体积计算公式如下：V=0.5×a×b2。V：肿瘤体积，a：肿瘤长边直径，b：肿瘤短边直径。 　　5.Fe3O4-MS/DOX-HANPs的安全性及抗肿瘤效果 　　待4T1移植瘤小鼠肿瘤体积约为50mm3时，将小鼠随机分成6组，每组6只；将PBS，DOX，HA修饰的二氧化硅装载的DOX（MS/DOX-HA），Fe3O4-MS/DOXNPs，Fe3O4-MS/DOX-HANPs和Fe3O4-MS-HANPs通过尾静脉注射到小鼠体内，每3d注射一次，每次注射完，将磁铁置于4T1移植瘤小鼠肿瘤部位30min，每3d检查各组小鼠体重变化及测量肿瘤组织大小。通过小动物成像仪分析Fe3O4-MS/DOX-HANPs在小鼠体内的分布情况，并对主要脏器进行Hamp;E染色，评估药物的毒副作用，并结合肿瘤生长曲线评价Fe3O4-MS/DOX-HANPs的抗肿瘤效果。 　　研究结果： 　　1.Fe3O4-MS-HANPs的结构表征及其生物学功能的研究 　　1）Fe3O4-MS-HANPs表征：FTIR和XPS显示，成功制备Fe3O4-MS-HANPs；TEM显示，所合成的Fe3O4-MS-HANPs具有典型的核壳结构，其形貌均一粒径大小在210nm左右； 　　2）Fe3O4-MS-HANPs类过氧化氢酶性质及还原性：Fe3O4-MS-HANPs能与H2O2反应，生成氧气；GSH能将Fe3O4-MS-HANPs中三价铁离子还原成二价铁离子。 　　2.Fe3O4-MS-HANPs的药物装载及释放的研究 　　1）Fe3O4-MS-HANPs的药物装载率：Fe3O4-MS-HANPs对抗肿瘤药物DOX装载前后，DOX的荧光信号变化，得出Fe3O4-MS-HANPs对DOX的装载率为65%；2）Fe3O4-MS/DOX-HANPs体外模拟不同pH响应释放：Fe3O4-MS/DOX-HANPs分散到体外模拟的酸性肿瘤微环境（pH=5.5）及正常生理环境下（pH=7.4），当Fe3O4-MS/DOX-HANPs浸入pH=5.5环境中，DOX迅速释放，在20h内，其释放率达到50%，而在正常生理环境下，80h仅有20%DOX释放。 　　3.Fe3O4-MS/DOX-HANPs的靶向传递及抗肿瘤效果的研究 　　1）Fe3O4-MS/DOX-HANPs的双靶向传递：Fe3O4-MS/DOX-HANPs在外部磁场的作用下，迅速在肿瘤组织聚集，且表面修饰的透明质酸能与肿瘤细胞表面的透明质酸受体结合，增加肿瘤细胞对Fe3O4-MS/DOX-HANPs的摄取； 　　2）Fe3O4-MS/DOX-HANPs的抗肿瘤效果：到达肿瘤组织的Fe3O4-MS/DOX-HANPs根据特殊的肿瘤微环境持续精准释放出DOX，有效抑制小鼠移植瘤的生长，并降低对机体的副作用。 　　研究结论： 　　1.以Fe3O4-MSNPs为模板，通过透明质酸分子修饰，成功制备了具有核壳结构双靶向功能的环境响应性Fe3O4-MS-HANPs； 　　2.Fe3O4-MS-HANPs具有过氧化氢酶活性的性质，使Fe3O4-MS-HANPs与H2O2反应产生氧气； 　　3.Fe3O4-MS-HANPs具有较高的药物装载率，且能与肿瘤细胞表面HA受体特异性结合，增加肿瘤细胞对Fe3O4-MS-HANPs的摄取，增加对肿瘤细胞的杀伤作用； 　　4.Fe3O4-MS/DOX-HANPs在体内运输过程中，在外部磁场的作用下，被动富集在肿瘤组织，并通过表面修饰的HA与肿瘤细胞表面的HA受体结合，增加肿瘤细胞对Fe3O4-MS/DOX-HANPs摄取。与单一的靶向药物载体相比，具有双靶向功能的Fe3O4-MS/DOX-HANPs能迅速在肿瘤组织聚集，根据特殊的肿瘤微环境持续释放药物，有效抑制肿瘤生长，并降低药物对机体的损伤。 　　第二章：叶酸修饰的红细胞膜包裹铁卟啉金属有机框架的构建及其联合抗肿瘤作用 　　研究方法： 　　1.FA-EM@GO-MOF的构建及其生物相容性 　　以氧化石墨烯（Grapheneoxide,GO），卟啉（Porphyrin，TCPP）和Fe3+为原料，制备GO-金属有机框架复合物（GOmetal-organicframework，GO-MOF），利用BET，X射线衍射（X-raydiffraction，XRD）和TEM对其进行结构表征。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析叶酸修饰的红细胞膜（FA-EM）包裹的GO-MOF（FA-EM@GO-MOF）表面相关蛋白的表达情况。将FA-EM@GO-MOF与巨噬细胞和4T1细胞共孵育，评估其免疫清除及靶向递送性能。通过细胞及小鼠实验，分析FA-EM@GO-MOF的生物相容性。 　　2.FA-EM@GO-MOF生物学功能 　　将FA-EM@GO-MOF浸入到不同浓度GSH溶液中，利用荧光光谱仪监测GSH对FA-EM@GO-MOF荧光信号的影响。将其与4T1细胞共孵育，通过荧光显微镜观察4T1细胞内氧探针RDPP的荧光信号，检测FA-EM@GO-MOF的产氧能力。FA-EM@GO-MOF暴露于近红外激发光下（Near-infraredirradiation,NIR），通过红外热成像仪验证FA-EM@GO-MOF纳米载体光热转化效率。利用核磁成像及普鲁士蓝染色，验证FA-EM@GO-MOF纳米载体在小鼠体内的分布。 　　3.FA-EM@GO-MOF药物装载释放及体外协同治疗 　　GO-MOF与DOX混合，形成GO-MOF/DOX，利用DOX装载前后荧光信号的变化，评估GO-MOF对DOX的装载效率。GO-MOF/DOX被FA-EM包裹，形成FA-EM@GO-MOF/DOX，将其浸入到体外模拟的肿瘤微环境中，利用DOX在不同环境中荧光信号的强弱，评估DOX的释放效果。将FA-EM@GO-MOF/DOX与4T1细胞和GES-1细胞共孵育，NIR照射，利用细胞增殖实验验证其对细胞的协同杀伤效果。 　　4.构建小鼠皮下移植瘤模型验证FA-EM@GO-MOF/DOX的安全性及抗肿瘤作用 　　构建小鼠抗肿瘤治疗模型，并随机分为7个治疗组：PBS,PBS+NIR，DOX，FA-EM@GO-MOF/DOX，GO-MOF/DOX+NIR，FA-EM@GO-MOF+NIR和FA-EM@GO-MOF/DOX+NIR组。治疗结束后，收集小鼠脏器和肿瘤组织，分别进行Hamp;E染色和原位末端转移酶标记技术染色，评估DOX的毒副作用和4T1细胞的杀伤效果；结合肿瘤生长曲线评估化疗/光动力治疗/光热治疗的联合抗肿瘤效果。 　　研究结果： 　　1.GO-MOF制备表征及其生物学功能的研究 　　1）GO-MOF制备及表征：TEM和SEM显示，成功制备了单分散尺寸大小为100nm且分布在GO表面的GO-MOF；荧光光谱仪显示，在正常情况下GO-MOF的荧光信号处于“Turnoff”状态。BET结果显示，GO-MOF具有较大的比表面积（1010m2/g）； 　　2）GO-MOF的生物学功能：高浓度GSH使GO还原成rGO，导致MOF从GO表面解离，GO-MOF的荧光信号“Turnon”；且GSH可促使MOF中的Fe3+还原成Fe2+导致MOF结构坍塌，促进药物的精准释放；GO-MOF在近红外区有较强吸收，在NIR照射下，表现出显著的光热转换性能。 　　2.FA-EM@GO-MOF表征及其生物学功能的研究 　　1）FA-EM@GO-MOF表征：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，FA-EM@GO-MOF蛋白图谱与红细胞膜蛋白图谱一致，此结果说明GO-MOF经过FA-EM包裹后，FA-EM@GO-MOF表面的膜蛋白保留良好。 　　2）FA-EM@GO-MOF的生物学功能：FA-EM@GO-MOF可有效避免被巨噬细胞吞噬，并与4T1细胞表面叶酸受体结合；核磁成像结果显示FA-EM@GO-MOF注入移植瘤小鼠体内24h后，主要聚集在肿瘤组织部位，说明FA-EM@GO-MOF具有靶向传递功能；光热转换研究表明FA-EM包裹GO-MOF后，未影响其光热转换性能。 　　3.FA-EM@GO-MOF协同抗肿瘤效果 　　1）1）FA-EM@GO-MOF抗肿瘤药物的装载与释放：GO-MOF对DOX具有较大装载量，形成的FA-EM@GO-MOF/DOX，具有肿瘤微环境控制药物的精准持续释放； 　　2）FA-EM@GO-MOF/DOX协同抗肿瘤治疗：FA-EM@GO-MOF/DOX与肿瘤细胞特异性结合，在NIR光照下，FA-EM@GO-MOF/DOX能有效抑制小鼠移植瘤的生长。 　　研究结论： 　　1.成功构建了新型诊疗一体化的GO-MOF纳米载体； 　　2.FA-EM@GO-MOF具有优异光热转换性能，而且能有效避免被机体免疫清除，并具有靶向传递功能； 　　3.FA-EM@GO-MOF纳米载体具有类过氧化氢酶的活性，可与H2O2反应，生成大量的氧气，有效增强后续光动力治疗效果； 　　4.肿瘤组织中高浓度GSH，不仅使FA-EM@GO-MOF中MOF与GO解离，使得MOF的荧光得以恢复，实现药物在肿瘤细胞内的实时示踪荧光成像；而且GSH还原Fe3+生成Fe2+，从而导致MOF结构坍塌，使得药物在肿瘤部位实现精准释放； 　　5.FA-EM@GO-MOF/DOX具有级联效应，实现化疗/光动力治疗/光热治疗三合一的联合治疗，有效提高机体抗肿瘤效果。