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摘要【背景】肠道缺血/再灌注（I/R）损伤通常由血栓栓塞或动脉粥样硬化导致的血管闭塞性疾病引起，因肠道急性缺血缺氧导致肠屏障破坏和菌群易位，最终引起多器官功能障碍。尽管医学影像诊断和临床治疗手段进展迅速，但与肠道I/R相关的死亡率仍保持在50-80％。在经典的级联损伤模式中，肠黏膜最容易受到I/R影响，其中肠上皮细胞首先受到损伤，然后激活固有层免疫细胞炎症反应，通过损伤相关分子模式（DAMPs）进一步加重肠上皮细胞受损。因此，寻找缓解上皮损伤的药物靶点有望从源头减轻肠道I/R损伤。既往对肠道I/R损伤治疗的分子靶点研究主要依赖于三气培养箱造模的二维细胞或者是动物肠道I/R损伤模型。然而，二维细胞模型与体内天然肠上皮空间异质性分布和多细胞表型的特征完全不同，且在三气培养箱中，氧含量下降至稳定低水平需要长达24小时，与体内肠道I/R损伤过程快速缺氧的情形有显著差异。再者，由于哺乳动物体内存在对慢性缺氧的内在分子调控机制，缓慢的氧气下降模式可能会重塑细胞内分子图谱，掩盖对急性缺氧复氧的治疗靶点的发现。此外，在动物肠道I/R模型中，肠上皮细胞容易受到邻近免疫细胞的影响，也会干扰上皮细胞炎症启动分子的发现。综上，由于缺乏整合上皮相似性和快速氧动力特征的精准体外模型，亟需寻找治疗肠道I/R损伤的分子靶标与药物研发的新手段。<br>　　【方法】受肠绒毛的自然结构（即肠上皮细胞包绕中央滋养型毛细血管）启发，本课题致力于研发一种仿生微血管化肠道类器官芯片。首先，通过微流控加工方式，得到基于pH响应的锌金属有机骨架（ZIF-8）/海藻酸钠（SA）水凝胶中空管道，并在管腔内移植人脐静脉内皮细胞（HUVECs），形成人工血管。然后，将人造血管和肠道类器官以类器官包绕血管的形式组装在芯片中。通过微流泵向人造血管中持续通入低氧培养基，时间为3小时，在人工血管界面发生气体交换，使得类器官中的氧气浓度快速下降，接着再向人工血管中通入正常含氧量的培养基，快速提升类器官中的氧含量，这一过程中，类器官受到快速缺氧复氧（HR）的影响。我们在类器官快速HR后，检测细胞损伤情况。随后，采用转录组学测序对比快速HR的肠道类器官以及正常氧气环境培养的类器官的RNA表达情况，从而筛选潜在治疗靶点，并通过慢病毒基因干扰以及过表达类器官模型、细胞模型、动物肠道缺血再灌注模型以及人体肠道缺血标本进行潜在靶点的功能验证。<br>　　【结果】我们成功构建血管化肠道类器官芯片。通过有限元分析和测氧仪检测，发现肠道类器官芯片中的氧气浓度可急剧下降，与三气培养箱（24小时）相比，该芯片能在更短的时间内（3小时）达到同水平的绝对缺氧状态，并诱发肠道类器官产生显著的氧化应激和细胞凋亡。将造模后的肠道类器官进行RNA高通量测序，发现嗅素蛋白4（Olfm4）基因在类器官芯片缺氧复氧后显著低表达，提示该基因下调可能是诱导肠道上皮炎症的关键信号分子。为了验证其功能，我们通过慢病毒基因载体构建Olfm4干扰或过表达的肠道类器官，发现该基因表达下调与类器官炎性反应加重相关。我们通过脂质体递送方式上调结肠上皮细胞FHC胞质内OLFM4水平，进一步证实其可减轻细胞炎症的生物学效应。同时，我们在动物模型以及人体标本中发现，在肠道I/R损伤初期，Olfm4表达水平上升，显示人体启动反馈性机制保护组织受损，然而，在肠道I/R损伤后期，Olfm4表达水平下降，肠道损伤进一步加重，提示Olfm4表达水平下降与肠道I/R后期组织损伤加重有关，通过慢病毒腹腔注射上调肠道Olfm4表达后，我们发现小鼠肠道I/R损伤减轻。以上结果表明，OLFM4可作为治疗肠道I/R损伤的分子靶点。<br>　　【结论】本研究揭示了微血管化肠道类器官芯片在重现与体内相似的氧微环境变化中的优势，凸显了该模型在药物靶点筛选方面的潜在功能，有望为缺氧相关疾病模型的构建和药物研发提供新的方法。同时，我们还发现OLFM4调控I/R导致的肠损伤，提示其有望成为减轻肠损伤的重要分子靶点。