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摘要研究背景：<br>　　具有致幻效应的血清素（5-HT）2A受体（5-HT2Areceptor,5-HT2AR）激动剂又称为经典致幻剂。经典致幻剂在药物成瘾与滥用方面存在很大的危险性，因此研究经典致幻剂诱导产生致幻效应的关键机制对于研究高效低毒的对抗药，并进一步减轻药物成瘾与滥用具有重要意义。啮齿类动物甩头反应（head-twitchresponse,HTR）是评价经典致幻剂诱导致幻效应的常用模型。经典致幻剂麦角酸二乙胺（lysergicaciddiethylamide，LSD）和2,5-二甲氧基-4-碘苯丙胺（2,5-dimethoxy-4-iodoamphet-amine，DOI）在代谢型谷氨酸受体2（metabotropicglutamatereceptor2，mGluR2）敲除小鼠中诱导的HTR次数较野生型小鼠显著降低，但可被病毒介导的mGluR2过表达逆转，表明mGluR2是经典致幻剂诱导HTR所必需的；同时5-HT2AR与mGluR2可形成异源二聚体，两者相互影响对方偶联的信号通路和诱导的动物行为，这为LSD、DOI和2,5-二甲氧基-4-甲基苯丙胺(2,5-Dimethoxy-4-methylamphetamine,DOM）等经典致幻剂诱导HTR的关键调控分子和作用机制探索提供了新方向。<br>　　研究目的：<br>　　探究mGluR2激动剂LY379268、LY354740、LY404039和反向激动剂LY341495调节多种经典致幻剂诱导HTR的普适性和信号通路机制，并基于5-HT2AR/mGluR2异源二聚体进行定量磷酸化蛋白质组学研究，进而探索与经典致幻剂诱导HTR相关的新的信号分子及通路。<br>　　研究内容和方法：<br>　　1.mGluR2激动剂与反向激动剂对LSD/DOM诱导的HTR的影响<br>　　C57BL/6J（C57）小鼠腹腔注射给予不同剂量LY379268（LY37）、LY354740（LY35）、LY404039（LY40）或LY341495（LY34），30min后经腹腔注射LSD或DOM，观察记录30min内小鼠HTR次数。C57小鼠腹腔注射给予不同剂量LY37、LY35、LY40和LY34，记录给药后1h内自发活动总距离以及每10min内的分段距离。<br>　　2.mGluR2激动剂与反向激动剂影响DOM所诱导HTR的相关信号通路研究<br>　　共转5-HT2AR和mGluR2的HEK-293T细胞：经LY35或LY34处理5min后，加入不同浓度DOM诱导15min，检测Gq和Gs信号改变；经5-HT2AR拮抗剂M100907处理5min后，检测LY34对DOM诱导的Gs信号的影响。共转5-HT2AR和mGluR23A突变体的HEK-293T细胞：经LY35或LY34处理5min后，加入不同浓度DOM诱导15min，检测Gq和Gs信号改变。<br>　　3.LY34增强LSD/DOM诱导的差异磷酸化定量蛋白质组学研究<br>　　稳定表达5-HT2AR的HEK-293T细胞瞬时转染mGluR2，采用抗-FLAG?M2磁珠免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）实验，验证5-HT2AR与mGluR2的相互作用。共转5-HT2AR和mGluR2的HEK-293T细胞分为5组：Vehicle（0.9%生理盐水）组、LSD组、DOM组、LY34+LSD组和LY34+DOM组。细胞先用Vehicle或LY34处理30min后，分别加入LSD或DOM，孵育30min后收集细胞蛋白样品，收集的样品采用同位素标记相对和绝对定量技术进行磷酸化蛋白质组学分析。分别对Vehicle、LSD、LY34+LSD组和Vehicle、DOM、LY34+DOM组进行两两比较后绘制韦恩图，对重叠区域的差异磷酸化蛋白质进行文献调研和分析。<br>　　4.PDHA1和RAPTOR与经典致幻剂诱导HTR的相关性研究<br>　　mTORC1调节相关蛋白（regulatoryassociatedproteinofMTORcomplex1,RAPTOR）与mTOR均为mTORC1的重要构成成分。稳定表达5-HT2AR的HEK-293T细胞瞬时转染mGluR2，加入DOM孵育30min，检测mTOR下游P70S6、RPS6、Akt和丙酮酸脱氢酶E1α亚基（PyruvatedehydrogenaseE1alphasubunit,PDHA1）磷酸化水平的改变。C57小鼠分别单次给予不同剂量的丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvatedehydrogenasekinase,PDK）抑制剂DCA，mTOR经典抑制剂Rapamycin或mTORC1选择性抑制剂Torin1、XL388、OSI-027，30min后经腹腔注射LSD、DOI或DOM，观察记录30min内小鼠HTR次数。C57小鼠单次给予不同剂量DCA、Rapamycin、Torin1、XL388和OSI-027，记录给药后1h内自发活动总距离以及每10min内的分段距离。<br>　　研究结果：<br>　　1.mGluR2激动剂与反向激动剂对经典致幻剂LSD/DOM诱导的HTR的影响<br>　　LY37、LY35和LY40可剂量依赖性抑制LSD或DOM诱导的小鼠HTR，LY34可增强LSD或DOM诱导的小鼠HTR。各剂量LY37、LY35、LY34和0.5mg/kgLY40对小鼠自发活动无显著影响，而2、5mg/kgLY40对小鼠自发活动有抑制作用。<br>　　2.mGluR2激动剂与反向激动剂调节DOM诱导HTR的信号通路<br>　　正常二聚体细胞中，DOM诱导的Gs信号通路可被LY35抑制，被LY34增强，而DOM诱导的Gq信号通路不被影响。5-HT2AR拮抗剂M100907可减弱LY34对DOM诱导的Gs信号通路的增强作用。突变二聚体细胞中，LY35对DOM诱导的Gs信号通路的抑制作用完全消失；LY34对DOM诱导的Gs信号通路的增强作用显著增强。<br>　　3.LY34增强LSD/DOM诱导的差异磷酸化定量蛋白质组学分析<br>　　Co-IP实验结果显示，5-HT2AR与mGluR2具有相互作用。在LY34+DOM_Vehicle、LY34+DOM_DOM中均有差异磷酸化表达的PDHA1和在DOM_Vehicle、LY34+DOM_Vehicle中均有差异磷酸化表达的RAPTOR，可能与致幻效应相关。<br>　　4.PDHA1与RAPTOR与经典致幻剂诱导HTR的相关性研究<br>　　DOM可增强P70S6、RPS6、Akt和PDHA1的磷酸化。DCA、Rapamycin、Torin1、XL388或OSI-027均可显著抑制LSD、DOI或DOM诱导的小鼠HTR，且对小鼠自发活动均无显著影响。<br>　　研究结论：<br>　　mGluR2激动剂与反向激动剂可通过5-HT2AR介导的Gs信号通路调节经典致幻剂诱导的HTR，且5-HT2AR/mGluR2异源二聚体在其中至关重要。在此基础上，经磷酸化蛋白质组学筛选和实验证实PDHA1与RAPTOR参与经典致幻剂诱导HTR，为经典致幻剂诱导HTR提供新的作用机制和研究方向。<br>　　创新点：<br>　　1.创新性发现mGluR2激动剂与反向激动剂通过Gs信号通路调节DOM诱导的小鼠HTR。<br>　　2.通过定量磷酸化蛋白质组学研究和信号通路研究，首次发现并证实PDHA1和RAPTOR参与了经典致幻剂诱导的小鼠HTR。