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高光耐受蓝细菌集胞藻PCC6803底盘的构建及解析

摘要蓝细菌是唯一可进行放氧光合作用的原核微生物,是地球重要的初级生产者。更重要的是,其作为光合底盘已被广泛的应用于多种生物燃料和高附加值化学品的合成。但是高光暴露导致蓝细菌中的光抑制和毒性物质活性氧(ROS)的过度积累,影响全球初级生产力,且极大的限制了蓝细菌的规模化培养。因此,探究高光耐受机制并构建高光耐受底盘是解决问题的关键。为此,以模式蓝细菌集胞藻PCC6803为对象,本论文开展了以下3个方面的研究:<br>  (1)高光耐受新机制的发现及解析。通过筛选突变体文库,发现HCO3-转运蛋白Slr1512参与了细胞的高光胁迫适应过程。实验证明,敲除slr1512的突变体显著增强了细胞对长期高光胁迫的耐受能力,OD750在10天后可达到WT的1.95倍。进一步研究发现,胞内HCO3-的含量可显著影响光系统II(PSII)的活性,导致高光下ROS的含量发生变化。实验结果证明,通过slr1512控制HCO3-的胞内含量进而影响PSII活性是关乎细胞高光耐受能力的关键因素之一。最后应用比较转录组学,鉴定了slr1512的敲除引起细胞全局基因变化的过程。<br>  (2)高光耐受底盘的构建。通过700天的实验室适应性进化获得了8株耐受2000μmolphotonsm-2s-1的菌株。实验证明,叶绿素a/类胡萝卜素的比值降低使进化菌株显示出不同于野生型的颜色表型。进化菌株在高光下的Fv/Fm、干重和糖原含量可达到正常光照下的野生型的1.2、1.4和2.1倍,证明进化菌株是更具有优势的光合底盘。最后,通过比较转录组学数据解析了进化菌株中不同于野生型的高光响应模式。<br>  (3)高光耐受进化菌株的解析。应用全基因组重测序技术鉴定到进化菌株中共计有51个基因发生了突变。其中,引入Y228H和P14L两种点突变slr0320的菌株在高光下第3天和第7天的OD750可达到WT的1.5倍和1.7倍。RNA结合蛋白编码基因slr0193的敲除菌株在高光下第7天的OD750可达到WT的1.8倍,对盐胁迫(NaCl)的适应能力却降低了,推测其通过调控不同的基因来响应这两种胁迫。随后将slr0193WT引入进化菌株导致其高光生长优势丧失了38%~77%,说明slr0193的提前终止和大片段插入是进化菌株耐受高光的关键因素。而构建的slr0320及slr0193双突变菌株高光耐受性并没有继续增强,表明基因之间的作用不是简单的叠加,不同进化菌株可能采取不同策略来提升耐受力。<br>  本论文对高光耐受底盘的构建与解析的研究夯实了长期高光适应性机制的理论基础,并为指导未来蓝细菌抗高光的耐受性工程改造提供了有用的见解。

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