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摘要应激是一种机体对外界刺激的应答，然而持续高强度的应激往往会导致机体代谢紊乱，诱发多种代谢疾病，危害机体健康。NAFLD（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一类以肝脏脂质异位沉积为特征的慢性代谢类疾病。大量研究指出，慢性应激是NAFLD的一个重要诱因，可以促进外周脂肪分解和胰岛素抵抗导致循环游离脂肪酸增加，扰乱肝脏脂代谢。此外，应激还能诱导肝脏氧化应激导致肝细胞凋亡，在肝脏疾病的发生发展中扮演重要作用。<br>　　ω-3长链多不饱和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids, ω-3 PUFAs）是一类重要的食源性脂肪酸，富含于鱼油，亚麻籽油。GPR120（G-protein coupled receptor 120）是一种 G蛋白偶联受体，其可以被 ω-3 PUFAs激活。目前已有研究报道，补充 ω-3 PUFAs可以通过抗炎和调节脂代谢的作用来有效改善NAFLD的症状。然而有关ω-3 PUFAs 抗应激作用的研究较少，对肝脏的氧化应激的调控作用还有待进一步探索。本研究通过体内和体外实验探索了ω-3 PUFAs对应激引起的肝脏脂质沉积的影响，并进一步揭示了ω-3 PUFAs缓解肝脏氧化应激的机制。<br>　　1、应激对GPR120功能及小鼠肝脏脂沉积影响的研究<br>　　首先在体外利用小鼠肝细胞 ALML2 细胞系研究糖皮质激素（glucocorticoids, GCs）对GPR120功能的影响，我们用皮质酮（corticosterone, CORT）处理AML12发现，CORT阻断了GPR120的激活，抑制了下游ERK1/2信号通路。CORT处理2、12和24小时可显著促进GPR120内吞。此外，CORT处理24小时后细胞膜上的GPR120表达显著降低，而胞浆内的GPR120显著升高，同时β-arrestin 2的表达也增加（Plt;0.05）。<br>　　为了研究ω-3 PUFAs对应激引起的肝脏损伤的作用，本研究中将36只8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：对照组、地塞米松（dexamethasone, DEX）处理组、亚麻酸（α-linolenic acid, ALA）处理组和DEX+ALA处理组。结果显示，DEX组小鼠肝脏表现出显著的脂质沉积，而 DEX +ALA 组能有效缓解肝脏脂质沉积状况。DEX组肝脏脂肪酸结合蛋白1（fatty acid-binding protein 1, FABP1）和激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase, HSL）显著下调，而ALA组FABP1和P-HSL蛋白表达升高，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, FASN）蛋白表达显著降低（Plt; 0.05）。此外，DEX抑制 GPR120/ERK1/2 信号通路，而 ALA可使其重新被激活，从而改善肝脏脂代谢紊乱。<br>　　糖皮质激素抑制了 GPR120的功能，而 ALA可以通过挽救 GPR120功能障碍改善应激引起的肝脂肪变性。GPR120在ω-3 PUFAs对抗应激引起的肝脏脂肪变性中发挥了重要作用。<br>　　2、DHA对棕榈酸引起的肝细胞损伤的影响<br>　　在小鼠肝细胞系AML12细胞上，以300 μM 棕榈酸（palmitic acid, PA）诱导的脂沉积为模型，50μM DHA共同处理24 h后，检测细胞损伤的水平。研究发现DHA处理可以显著缓解 PA 引起的细胞活力降低和凋亡增加，抑制了 Caspase-3酶活性，并减少了PA处理导致的过量ROS的产生（Plt; 0.05）。脂质过氧化相关的环氧合酶2 （Cyclooxygenase 2, COX2）的基因和蛋白表达在PA组显著升高，而在PA+DHA组显著降低（Plt;0.05），此外DHA组ALOX12和CYP2c70基因表达显著高于PA组（Plt; 0.05）。更进一步我们检测了 PA和 DHA处理对细胞内不饱和脂肪酸及其氧化脂质的影响，结果显示，与对照组相比，PA处理显著降低了 ALA、GLA、EPA、FA22:4、FA20:3、PGD2、9-HODE 和 13-HODE 的表达；与 PA 组相比，DHA+PA 组中 18-HETE、20-HETE、11-HDHA、13-HDHA、20-HDHA、19,20-EDP表达显著升高。<br>　　综上所述，PA的脂毒性激活了细胞凋亡途径和氧化应激，DHA处理有效缓解了PA脂毒性引起的细胞损伤。此外，PA的处理导致了大多数不饱和脂肪酸及其代谢产物含量降低，这可能和ROS和COX2的升高有。DHA处理后COX2和ROS的升高被抑制，结果提示DHA对PA引起的肝脏凋亡的保护作用可能与其抗氧化功能有关。<br>　　3、DHA通过激活Nrf2信号通路缓解肝脏氧化应激<br>　　氧化应激在NAFLD的发生与发展中扮演了重要角色，氧化应激产生的过量ROS通过损伤细胞器破坏核酸和蛋白结构引起细胞凋亡，导致NAFLD病情进一步恶化，而通过干预肝脏中的氧化应激，减少 ROS 的产生，可以有效缓解肝脏损伤。虽然有很多研究指出通过补充DHA可以改善NAFLD的症状，但DHA对肝脏氧化应激的影响尚未有定论，其具体机制也不清楚。本研究的目的是探讨 DHA在肝脏中的抗氧化作用，并阐明其机制。我们在体外利用小鼠肝细胞系 AML12 为模型，DHA 和GPR120激动剂TUG891预处理12 h，随后H2O2刺激2 h诱导氧化应激，并检测ROS水平及抗氧化的相关指标。结果表明，DHA可抑制 H2O2引起细胞凋亡和 ROS水平 升高，并激活了细胞抗氧化应答，SOD1和 HO-1蛋白表达显著升高（Plt; 0.05）；其上游转录因子Nrf2也被DHA激活，Nrf2总蛋白和核蛋白表达显著增加（Plt;0.05）。此外，我们发现 ERK1/2信号通路在氧化应激中被抑制，但在 DHA处理后被重新激活。通过ERK1/2抑制剂（U0126）抑制ERK1/2的磷酸化后，DHA对肝细胞氧化损伤的保护作用消失，Nrf2的激活也被抑制。<br>　　综上所述，DHA可以改善 H2O2引起的肝细胞氧化损伤，减少 ROS的产生和细胞凋亡。DHA通过GPR120激活ERK1/2信号通路，促进Nrf2的入核，调控其下游抗氧化酶SOD1和HO-1的表达，从而缓解细胞的氧化应激。<br>　　4、DHA对氧化应激引起的线粒体损伤的保护作用及机制研究<br>　　线粒体是ROS产生的主要细胞器，在氧化应激过程中极易受到ROS攻击导致其功能丧失。本文第七章实验证实 DHA可以通过促进细胞抗氧化应答缓解肝细胞氧化应激，但 DHA能否改善肝脏线粒体损伤目前研究较少，我们进一步探究了 DHA对氧化应激导致的线粒体损伤的保护作用及机制。我们利用小鼠AML12细胞系，DHA和TUG8191预处理12 h，再通过H2O2刺激2 h诱导肝细胞氧化应激，检测线粒体功能变化及潜在调控机制。结果表明，H2O2刺激导致自噬流受损而DHA恢复了被抑制的自噬通量，并提高了 LC3II，Beclin1 的表达，促进了 P62/SQSTM1 的降解，激活保护性自噬（Plt; 0.05）。此外，线粒体的功能在DHA的处理下得到恢复，线粒体膜电位降低的状况得到改善，生物合成增加，分裂减少，提高了线粒体质量（Plt;0.05）。DHA激活AML12细胞中PINK1/Parkin介导的线粒体自噬（Plt;0.05），促进了损伤线粒体的清除。U0126 抑制 ERK1/2 磷酸化发现，DHA 对线粒体自噬的促进作用降低（Plt;0.05），进一步证实了ERK1/2的表达参与了线粒体自噬的调控。<br>　　随后我们在体内进一步验证了 DHA 对肝脏的保护作用，24 只 8 周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为3组：CON组（CON），CCl4注射组（CCl4）和DHA灌胃 +CCl4注射组（DHA+CCl4）。DHA每天以50 mg/kg体重灌胃，每只灌胃150μl，持续一周，第八天腹腔注射CCl4（2 ml/kg体重），24h后采取血液和肝脏样品。结果发现DHA可以缓解CCl4引起的血浆中AST（P=0.06）、ALT和LDH（Plt;0.05）的升高，并显著增加了肝脏中抗氧化酶 SOD 和 GSH 的水平（Plt; 0.05），肝脏自噬相关蛋白LC3II和Beclin1的表达在DHA处理组也显著升高。<br>　　总之，我们以上的数据表明 DHA 通过 GPR120/ERK1/2 信号通路激活了PINK1/Parkin相关的线粒体自噬途径从而改善了线粒体功能，保护肝细胞免受氧化应激的损伤。