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摘要开花植物雄配子体的花粉管生长依赖于高尔基体加工修饰的细胞壁多糖组分、细胞膜糖脂及外泌蛋白。高尔基体是由具有顺面（cis-）到反面（trans-）极性的高尔基垛叠组成。关于这种极性结构的形成与维持机制研究，在哺乳动物和酵母中已获得初步成果，但在植物领域进展相对缓慢。前期研究表明高尔基体定位的COG拴系复合体亚基COG3/6/8均在植物高尔基体的形态维持以及雄配子体发育过程发挥功能作用，但具体的分子机制仍需要进一步研究。本研究利用COG8筛选拟南芥cDNA酵母文库得到互作蛋白CCP1，并研究其在拟南芥雄配子发育及营养生长中发挥的功能作用，主要研究结果如下：<br>　　1. COG8与CCP1相互作用<br>　　以COG8为诱饵蛋白筛选拟南芥cDNA文库得到CCP1蛋白，利用酵母双杂交、双分子荧光互补成像、GST Pull-Down证实CCP1与COG8蛋白间存在直接相互作用。<br>　　2. CCP1是一类小家族蛋白且在拟南芥花中特异性表达<br>　　通过生物信息学手段发现，拟南芥中CCP1还有两个同源基因CCP1 related1 （CCPR1）和 CCP1 related2（CCPR2），进化分析表明，非植物系统中不存在CCP1同源蛋白，CCP1、CCPR1、CCPR2以三个独立的进化分支存在于植物系统，另外蛋白结构域分析表明CCP1中含有的CaM结合结构域在进化过程中十分保守。<br>　　生物微阵列数据分析表明CCP1在拟南芥各组织中呈组成型表达，但在花粉中表达最强烈。设计将CCP1的全长cDNA与pET-28a标签融合表达以制备多克隆抗体，验证该抗体的特异性后，用于检测拟南芥各组织中CCP1表达量，结果与生物微阵列数据一致。<br>　　3. CaM2与CCP1互作位点的鉴定<br>　　本实验室同期研究发现外源添加钙调素拮抗剂 TFP（Trifluoperazine），不仅会抑制野生型花粉管生长还会导致高尔基体形态出现异常，暗示CaM可能与其下游效应因子CCP1共同在高尔基体形态维持和花粉管生长中发挥功能作用。本研究利用体外GST Pull-Down实验证明CCP1与CaM2（Calmodulin2）的相互作用依赖于Ca2+，并鉴定出CCP1与CaM2互作的三个关键位点，它们分别是CCP1氨基酸序列上第466位的赖氨酸（K）、469和480位的精氨酸（R）。<br>　　4. CCP1参与孢子体植株的生长发育过程<br>　　ccp1-2/+雄配子体遗传信息无法传递到胚囊导致无法获得纯合突变体，为进一步研究 CCP1 功能作用，本研究利用 Dex 诱导性 RNAi 技术创制了Dex:amiRNA-ccp1 转 基因植 株。 通过 qRT-PCR 对光照培 养 六 天 的Dex:amiRNA-ccp1 幼苗基因型进行确定，Dex:amiRNA-ccp1 小苗中 CCP1 的表达量下调。光学显微镜下观察到Dex:amiRNA-ccp1幼苗矮小、子叶黄化且根尖肿胀。FM4-64染色发现，与野生型植株相比，Dex:amiRNA-ccp1幼苗根细胞内吞出现延迟现象。