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摘要随着CRISPR系统的发现，掀起了一阵基因编辑领域研究的热潮。目前CRISPR-Cas靶向编辑DNA相关的系统的研究基本成熟。然而，基于CRISPR-Cas13靶向RNA相关系统也有报到。本研究继CRISPR-Cas13介导特定C到U替换(RNAeditingforspecificctouexchange，RESCUE)的RNA碱基编辑系统，利用CRISPR-Cas9-AID介导的DNA碱基编辑系统对RESCUE系统中Cas13和胞苷脱氨酶随机引入突变，实现在哺乳动物细胞中对RNA编辑系统的持续进化。进化分为突变和筛选两部分，包括三大步骤：表达载体构建及细胞系建立、持续多轮进化及筛选和功能验证。<br>　　1.基于RESCUE系统构建新的CRISPR-CasRNA编辑系统慢病毒表达载体：依据Zhang,F[1]等人最新优化的RESCUS-S系统中所用到的dRanCas13b-ADAR质粒，利用基因重组构建dRanCas13b-ADAR相关质粒。构建突变系统：构建pTE-dCas9-NeoR，构建PGL-ms2-gRNA-MS2-AID-BleoR，gRNA（guideRNA）和活化诱导性胞苷脱氨酶（Activation-inducedcytidinedeaminase，AID）靶向dRanCas13b-ADAR区域。构建筛选系统：构建dRanCas13b-ADAR靶向GFP的gRNA表达质粒。筛选质粒分为高效编辑策略（ARACG）和缩小窗口策略(ADAR)两种策略，分别为了能够筛选出靶向ppib基因位点实现C＞U编辑效率提高的突变体和缩小编辑窗口的突变体。<br>　　2.构建完成相关表达载体后，以慢病毒形式以稳定转染进入293T细胞中构建相应的细胞系并进行多轮进化。经过突变后进行抗生素筛选出能够存活的细胞进行测序，实时监控持续多轮筛选后突变体情况。在经过多轮进化，抗生素浓度持续增加，提高筛选压力情况下，根据测序已发现了ADAR脱氨酶发生碱基替换，删除，并导致氨基酸发生改变，并且发现部分氨基酸替换有富集情况。<br>　　3.利用分子克隆将发生碱基改变的ADAR脱氨酶和Cas13连接到原有的慢病毒载体上，测序发现突变体的突变位点以及突变类型有富集。同时挑选出突变体进行，功能性验证，利用原有GFP报告系统初步进行筛选出了靶向编辑能力提高的突变，此实验的阳性对照是未进行多轮进化的Lv-dRanCas13b-ADAR-Blast。<br>　　4.本研究成功建立首个在哺乳动物细胞内持续进化RNA碱基编辑器的平台。相较于先前原核细胞和酵母细胞进化平台，更利于达到更好进化效果。经过多轮持续进化筛选并验证功能获得了缩小编辑窗口的突变体DR-4和DR-7以及编辑效率略高于野生型的突变体RCG-87；成功建立了一个验证基于Cas13RNA碱基编辑器编辑效率的报告系统。