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摘要研究背景：<br>　　肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，5年生存率低，仍然是一个严重的全球公共健康问题。肺癌的发病机制非常复杂，尚未完全阐明，目前的研究重点主要集中在寻找新的肿瘤转移相关标志物和探索更有效的靶向及免疫治疗方法。SSRP1已被证实可参与DNA转录、复制、修复及细胞周期调控等多种生物学过程，在肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤的发生发展中发挥了重要作用。大量证据表明，SSRP1可能是肿瘤治疗的潜在靶点。DNA修复赋予肿瘤细胞对基于破坏DNA的抗癌疗法抵抗力，而γH2AX对识别和修复DNA损伤至关重要。同时在多种肿瘤中WNT信号通路被异常激活。miRNA作为一种高度保守的小非编码RNA，是一种关键的基因表达调控分子，据报道其在肺癌增殖、凋亡和转移中具有重要作用。其中，miRNA-28-5p表达异常已被证实与肿瘤发生相关。然而，目前尚不清楚SSRP1在肺癌发生发展中的作用机制以及SSRP1与miRNA在肺癌发生发展中的关系。<br>　　目的：<br>　　本研究拟探索肺癌发生发展、侵袭及转移的分子机制，开发新的分子靶向治疗策略，为预防肺癌的发生及改善患者预后提供理论基础和实验依据。<br>　　方法：<br>　　1.通过检索生物信息数据库（UALCAN和GEPIA）查找SSRP1在正常肺组织和肺癌组织中的表达情况，分析SSRP1表达与肺癌患者生存率是否相关；同时，利用免疫组织化学染色技术验证不同肿瘤分期的人肺癌组织中SSRP1的表达情况。<br>　　2.应用多种肺癌细胞系（A549、NCI-H446、H1299、PC9及LLC）和人正常肺上皮细胞（BEAS-2B，B2B），通过Westernblot进行验证SSRP1表达情况。<br>　　3.应用RNAi技术下调SSRP1，利用CCK8、细胞生长计数及克隆形成实验检测对NCI-H446和H1299细胞增殖的影响；利用Transwell实验证明SSRP1对NCI-H446和H1299细胞迁移和侵袭的影响。<br>　　4.应用Westernblot分析SSRP1对NCI-H446和H1299细胞DNA损伤标记物γH2AX变化的影响；使用q-RTPCR和Westernblot检测SSRP1对NCI-H446和H1299细胞凋亡和周期相关基因和蛋白的改变。<br>　　6.应用NCI-H446细胞构建肺癌异种移植瘤模型，体内证明SSRP1沉默对肺癌异体移植瘤的作用。<br>　　7.分别构建含有野生型或突变型SSRP13?UTR的荧光素酶表达质粒（分别为report-SSRP1-wt和report-SSRP1-mut），转染NCI-H446细胞，进一步确认SSRP1是否为miRNA-28-5p的靶基因。<br>　　8.构建miRNA-28-5pmimics和miRNA-28-5pinhibitor来进一步验证miRNA-28-5p对SSRP1的影响：将miRNA-28-5pmimics和miRNA-28-5pinhibitor分别转染NCl-446和H1299细胞，利用Westernblot验证miRNA-28-5p对SSRP1的影响。<br>　　9.分别应用CCK8、细胞计数以及克隆形成实验证明miRNA-28-5p对肺癌细胞生长的影响。<br>　　结果：<br>　　1.与正常组织和细胞相比，SSRP1在肺癌组织和肺癌细胞系中高表达，且与SSRP1低表达患者相比，SSRP1高表达的肺癌患者的总生存率较低。<br>　　2.CCK8结果显示，与NC未处理组相比，SSRP1siRNA处理NCI-H446和H1299细胞24h、48h和72h后，细胞活力显著下降，且呈时间依赖性；细胞计数实验结果显示，与NC组相比，siSSRP1组细胞数量显著减少；细胞克隆形成实验显示，与NC组相比，siSSRP1组克隆形成的数量显著减少。<br>　　3.流式细胞术结果显示，与NC组相比，siSSRP1组处于G0/G1期的NCI-H446和H1299细胞数量显著增多。同时，siSSRP1组凋亡细胞比例明显高于NC组。<br>　　4.迁移和侵袭实验结果显示，与NC组相比，下调SSRP1使发生迁移和侵袭的肺癌细胞数量降低。<br>　　5.Westernblot结果显示，与NC组相比，siSSRP1组总蛋白中p-GSK3β和β-catenin的表达显著下降，核蛋白中p-GSK3β和β-catenin也受到显著抑制；同时，Westernblot结果显示，与NC组相比，siSSRP1组γH2AX蛋白水平显著上调。<br>　　6.与阴性对照组相比，siSSRP1组小鼠肿瘤体积显著缩小，促凋亡基因Bax表达明显上调、抗凋亡基因Bcl-2表达明显下调，周期相关基因CyclinD1表达降低，P21表达升高。此外，siSSRP1组总蛋白提取物中p-GSK3β和β-catenin的表达显著下降。<br>　　7.双荧光素报告酶基因结果显示，与NCmiRNA组相比，仅有miRNA-28-5pmimics和3?UTR-WT联合处理组荧光素酶活性受到显著抑制，而3?UTR-MUT在相同条件下荧光素酶活性并未发生显著变化；同时，Westernblot结果显示，与NC组相比，miRNA-28-5pmimics组SSRP1表达显著下调，而miRNA-28-5pinhibitor组SSRP1表达显著上调。<br>　　8.CCK8结果显示，与NCmiRNA组相比，miRNA-28-5pmimics组细胞活力在48h和72h显著下降，而miRNA-28-5pinhibitor组细胞活力显著高于NCmiRNA组；此外，与NCmiRNA组相比，miRNA-28-5pmimics组细胞数量和克隆形成数量显著下降，而miRNA-28-5pinhibitor组细胞数量和克隆形成数量显著高于NCmiRNA组。<br>　　结论：<br>　　抑制SSRP1能够阻断WNT信号通路，一方面通过影响周期相关基因的表达导致细胞周期阻滞，另一方面调控肺癌癌基因与抑癌基因的表达以及诱导DNA损伤，触发凋亡，从而进一步干预肺癌的发生发展，而SSRP1对肺癌的这种抑制作用受到miRNA-28-5p的负调控。