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摘要目的：<br>　　制备带有取向性的PGCL纳米纤维支架，并通过固定化生长因子DOPA-IGF1和DOPA-NGF，对支架进行改性使其具备特定生物功能。将其与神经干细胞结合构建神经组织工程支架，用于脊髓损伤的修复研究并探讨其机制。<br>　　方法：<br>　　第一部分：首先，以静电纺丝技术为基础，通过对溶液浓度、滚动接收器和喷丝口之间的距离、电压等静电纺丝工艺参数进行调节，制备带有取向性的不同参数下的纳米纤维支架。通过不同实验方法对支架的理化性能（表面形貌、亲疏水性、力学性能等）进行评价。选取最佳的工艺参数制备后续实验所需材料。其次，从胎鼠（孕13-15天的SD大鼠的胎鼠）大脑皮层中原代提取神经干细胞并通过悬浮培养的方式进行扩增，使用特征性蛋白的免疫荧光染色等方式进行鉴定。最后，通过材料浸提液培养细胞及在材料表面进行细胞培养并进行细胞活死染色等方式对静电纺丝纳米纤维支架的生物安全性进行评价。<br>　　第二部分：首先，通过基因工程技术，利用重组表达融合蛋白的方法制备带有由赖氨酸及络氨酸构成的DOPA黏附基团前体序列的胰岛素样生长因子（YKYKY-IGF1）和神经生长因子（YKYKY-NGF），并通过络氨酸羟化酶反应形成带有DOPA结构域的固定化重组生长因子DOPA-IGF1和DOPA-NGF。使用蛋白质印记（WB）等方式对蛋白进行表征。其次，通过酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）对固定化生长因子的黏附性和稳定性进行分析。使用固定化生长因子对纳米纤维支架进行改性，并通过接触角、傅里叶变换红外光谱检测、XPS等方法对改性前后的材料进行对比表征。最后，通过CCK-8方法及蛋白质印记（WB）、免疫荧光染色等方式探讨分析不同浓度的生长因子对神经干细胞的增殖及分化的影响，筛选出最佳浓度进行后续实验。<br>　　第三部分：首先，根据前期实验结果构建四种固定化生长因子功能化静电纺丝支架并将神经干细胞与其共培养。然后通过EdU细胞增殖检测、蛋白质印记（WB）、免疫荧光染色等方法研究四种生物活性支架上神经干细胞的增殖、分化变化，进而探讨单独应用DOPA-IGF1、DOPA-NGF及两种生长因子联合应用时对神经干细胞的细胞行为调控作用。最后，通过转录组学探讨分析单因子及双因子对神经干细胞行为调控机制。<br>　　第四部分：首先，建立SD大鼠T9脊髓全切横断损伤模型，然后根据前期实验结果构建神经组织工程支架并将其移植到大鼠脊髓损伤处，并进行持续8周的术后观察护理。通过足迹实验、BBB评分分析大鼠运动功能的恢复情况。最后，对各组大鼠进行脊髓组织取材，使用HE染色、固蓝染色及免疫荧光染色对大鼠脊髓损伤处的修复情况进行分析，评估损伤处空腔面积、新生神经元、胶质瘢痕、髓鞘再生、轴突生长、新生血管及局部炎症反应等情况。<br>　　结果：<br>　　第一部分实验结果：根据正交试验设计分组并对纳米纤维支架进行理化性能评价。SEM结果提示在使用GA/CL为2/8的高分子聚合材料、纺丝液浓度为15wt%、纺丝距离（滚动接收器和喷丝口之间的距离）为18cm时，可制备形貌良好的纳米纤维支架。纺丝直径均匀，纺丝光滑且取向性良好、无断裂或串珠样结节，最有利于细胞黏附及迁移；接触角检测显示各组样品接触角均大于90°，提示纳米纤维支架整体属于疏水材料；力学性能检测提示该支架具备一定的强度及韧性；通过特征性蛋白Nestin的免疫荧光染色对提取的胎鼠原代神经干细胞进行鉴定，结果显示提取成功；浸提实验及材料表面细胞活死染色结果显示材料生物安全性良好。<br>　　第二部分实验结果：通过基因工程技术表达和制备Y-IGF1和Y-NGF成功，通过酪氨酸羟化酶反应生成具有较强黏附力的固定化生长因子DOPA-IGF1和DOPA-NGF。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其黏附性和稳定性。结果表明重组生长因子具有较强黏附性，且高浓度生长因子与材料结合紧密，稳定性强，不易释放。接触角、傅里叶变换红外光谱检测、XPS等方法对材料改性前后的表征对比提示重组生长因子对纳米纤维支架改性成功，亲水性大幅增加，有利于细胞黏附生长。我们以单位面积固定化生长因子的量为计量单位，通过CCK-8法、蛋白质印记（WB）、免疫荧光染色得出不同浓度分组的D-IGF1及D-NGF均对神经干细胞的增殖和神经元方向分化有促进作用，其中50ng/cm2时，效应最佳，因此我们选取该浓度进行后续实验。<br>　　第三部分实验结果：成功构建固定化生长因子功能化静电纺丝支架（Control、D-IGF1、D-NGF、D-IGF1＆D-NGF）并将神经干细胞与其共培养，EdU细胞增殖检测显示双重固定化生长因子组的神经干细胞具有最强的增值活性，蛋白质印记（WB）、免疫荧光染色结果显示与D-IGF1组相比，D-NGF组能使更多的神经干细胞向神经元方向分化并显著促进轴突生长，而两种因子联合应用时（双因子组）对神经干细胞向神经元方向的分化效应和对轴突生长促进作用最强。转录组学分析提示单独使用D-IGF1或D-NGF或将两种重组生长因子联合使用，对神经干细胞的基因表达和细胞行为均具有调控作用，两种生长因子联合应用时，对细胞的基因表达调控最为明显，且D-NGF可能对神经干细胞的基因表达调控起主导作用，D-IGF1的加入可能对D-NGF的调控方式造成了变化，二者相互影响可能产生了协同和叠加作用，从而增加了INNVSN组的差异基因表达并产生了更强的生物学效应，最终对细胞的旁分泌、细胞存活、分化、迁移、血管形成、轴突生长以及炎症介导等功能产生一定影响，可能涉及到的信号通路包括：MAPK/ERK通路、PI3K/Akt通路等。<br>　　第四部分实验结果：构建搭载神经干细胞和双重固定化生长因子的神经组织工程支架并将其植入脊髓横断全切大鼠的损伤部位。行为学评估显示与其他实验组相比，植入神经组织工程支架组大鼠的运动功能恢复程度最好。HE染色、固蓝染色、免疫荧光染色等组织学评估显示搭载双重固定化生长因子的神经组织工程支架能够有效地促进损伤部位神经元再生、轴突生长、血管再生，同时对瘢痕形成和局部炎症反应也有一定的抑制作用。<br>　　结论：<br>　　（1）使用静电纺丝技术，通过调整不同工艺参数可制备具有一定形貌特征、力学性能及降解性能的PGCL纳米纤维支架，并具备良好的生物安全性。<br>　　（2）使用基因工程技术成功制备固定化重组生长因子D-IGF1及D-NGF，其具备较高的黏附性、稳定性及生物活性，将其用于生物材料表面改性，可使生物材料具备一定的生物学功能。<br>　　（3）D-NGF修饰的纳米纤维支架比D-IGF1更能有效地促进神经干细胞向神经元分化并促进轴突生长，而两种生长因子联合应用具备更强的生物学效应。<br>　　（4）搭载神经干细胞的双重固定化生长因子修饰的PGCL纳米纤维支架在体内可有效地促进脊髓损伤大鼠损伤部位神经元再生、轴突生长、血管再生，同时对瘢痕形成和局部炎症反应也有一定的抑制作用。