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摘要酒精性慢性胰腺炎（alcoholicchronicpancreatitis,ACP）是最常见的慢性胰腺炎（chronicpancreatitis,CP），其主要特征是胰腺纤维化，其发病率和患病率呈上升趋势，目前尚缺乏有效的治疗策略。转化生长因子β1（transforminggrowthfactor,TGF-β1）是重要的致纤维化因子，可刺激胰腺星状细胞（pancreaticstellatecells,PSCs）激活并分泌细胞外基质（extracellularmatrix,ECM），促进胰腺纤维化。维生素D（vitaminD,VD）是一种多能类固醇激素，已被证实为细胞增殖、凋亡、分化和自噬的多效调控因子。研究表明，VD缺乏在CP患者中普遍存在。维生素D受体（vitaminDreceptor,VDR）是VD发挥作用的核受体。有研究初步显示VD及其类似物可通过抑制PSCs激活和ECM的产生来抑制胰腺纤维化，提示VD有可能是治疗胰腺纤维化的潜在药物。然而，目前关于PSCs中VDR的表达特点及其与TGF-β1含量或ACP胰腺纤维化程度的相关性尚不清楚；VD/VDR通路对PSC介导胰腺纤维化的蛋白表达谱的抑制作用及其调节机制尚未完全阐明。本论文从以下三个部分就VD及其受体通路抑制PSC介导胰腺纤维化的实验研究进行阐述。<br>　　第一部分：VDR在ACP患者PSC的表达特征及VD靶向PSC抗纤维化的潜在性研究<br>　　研究目的：<br>　　明确VDR在ACP患者PSC中的表达特征及其与TGF-β1含量和胰腺纤维化程度的关系，探索VD靶向PSC抗纤维化的潜在价值，评估ACP患者使用VD的合理性。<br>　　研究方法：<br>　　（1）通过免疫组化染色了解ACP胰腺组织中VDR的表达情况。（2）采用免疫荧光双染、qRT-PCR、VanGieson染色比较ACP患者和健康对照（HC）胰腺中VDR+PSC、COL1A1mRNA和胶原沉积面积差异以及VDR+PSC与COL1A1mRNA和胶原沉积面积的相关性。（3）利用大鼠的PSC系（RP-2细胞）构建体外细胞模型，采用qRT-PCR、WesternBlot、免疫荧光技术检测酒精（Alcohol,ALC）对VD类似物钙泊三醇（Calcipotriol,Cal）诱导VDR表达的影响。（4）ELISA法检测血清和RP-2细胞上清中TGF-β1水平，明确TGF-β1在ACP胰腺纤维化和PSC激活中的作用。（5）质谱检测ACP和HC人群血清中25(OH)D3水平，ELISA法检测血清COL1A1水平，评估ACP患者VD缺乏对COL1A1生成的影响。<br>　　研究结果：<br>　　（1）ACP患者胰腺组织中胰岛细胞、腺泡细胞和间质细胞均表达VDR，而HC人群的VDR仅在胰岛表达；ACP胰腺中大多数活化的PSC均表达VDR。（2）ACP胰腺中VDR+PSC、COL1A1mRNA和胶原沉积面积显著高于HC，VDR+PSC数与COL1A1mRNA含量和胶原沉积面积均呈正相关(r=0.82,P＜0.01;r=0.70,P＜0.01)。（3）ALC可诱导RP-2细胞产生和分泌TGF-β1，ALC可增强Cal诱导RP-2细胞VDR的表达(P＜0.001)。（4）ACP患者血清或胰腺中的TGF-β1水平较HC显著升高(P＜0.001)。（5）ACP组血清25(OH)D3水平显著低于HC组(P＜0.001)，ACP组血清中COL1A1的水平显著高于HC组(P＜0.001)。<br>　　结论：<br>　　ACP患者VD缺乏可能是触发TGF-β1介导的COL1合成的一个易感因素，激活的PSC是VD/VDR通路的靶细胞。由此可见，VD靶向PSC可能成为治疗ACP胰腺纤维化的潜在途径。<br>　　第二部分：VD类似物钙泊三醇对TGF-β1诱导PSC致纤维化蛋白谱的抑制作用<br>　　研究目的：<br>　　揭示钙泊三醇（Cal）拮抗TGF-β1诱导PSC介导纤维化发生的蛋白表达谱的变化特征以及Cal拮抗纤维化的作用。<br>　　研究方法：<br>　　（1）RP-2细胞接种在10cm培养皿中，采用2.5%FBSDMEM培养24h,然后换用1%FBSDMEM继续培养12h，细胞分三组，①对照组(载体缓冲液)，②TGF-β1(10ng/ml)组，③TGF-β1(10ng/ml)+Cal(100nM)组，继续培养48h后收集RP-2细胞，然后进行蛋白提取，胰酶酶解，液相色谱-质谱联用进行分离，采用生物信息学分析方法对质谱下机数据进行质控、注释、功能分析以及筛选差异蛋白。（2）采用WesternBlot对随机选取的6种差异蛋白进行实验验证；采用小干扰RNA(smallinterferingRNA,si-RNA)敲低RP-2细胞的VDR基因，qRT-PCR明确Cal是否通过VDR途径拮抗上述差异蛋白的mRNA表达。<br>　　研究结果：<br>　　（1）三组样品检测到5712种共享蛋白质，以差异倍数(Foldchange,FC)＞|±1.5|，p＜0.05为差异蛋白的筛选标准，TGF-β1组较Ctrl组有253种上调蛋白和267种下调蛋白，TGF-β1+Cal组较TGF-β1组有60种上调蛋白和97种下调蛋白。（2）Cal能够显著下调TGF-β1诱导PSC合成的16种关键致纤维化蛋白，其中7种为ECM成分(COL4A1,COL5A2,COL1A1,COL1A2,COL5A1,COL3A1和EMILIN1)，2种细胞骨架蛋白(VIM和α-SMA)，2种纤维化相关因子(RUNX1和TRAF2)，TIMP1,CCN1,ITGA11，1种粘附支架蛋白(TGFB1I1)和1种介导TGF-β1致纤维发生的酶(ENPP1)。（3）Cal通过VDR途径拮抗TGF-β1诱导PSC激活及纤维化蛋白的合成。<br>　　结论：<br>　　Cal通过VDR途径拮抗TGF-β1诱导PSC合成的多种重要的致纤维蛋白，而这些蛋白部分属于ECM，其它部分可参与PSC激活、分化、粘附等功能。因此，外源补充VD可能是一种治疗胰腺纤维化的方法。<br>　　第三部分：钙泊三醇通过下调RUNX1抑制TGF-β1/SMAD3信号通路介导PSC内COL1的合成<br>　　研究目的：<br>　　明确RUNX1在TGF-β1/SMAD3信号通路调节COL1合成的作用，进而阐明Cal拮抗PSC合成COL1的潜在机制，为VD及其类似物治疗胰腺纤维化提供实验基础和理论依据。<br>　　研究方法：<br>　　10ng/mlTGF-β1处理RP-2细胞作为本研究的细胞模型。免疫荧光用于检测RUNX1的细胞定位；采用qRT-PCR检测RUNX1，COL1A1，COL1A2mRNA；采用WesternBlot检测RUNX1，SMAD2/SMAD3/pSMAD3，COL1A1,COL1A2和β-Tubulin蛋白；采用Co-IP检测pSMAD3/RUNX1/CBFβ复合物；si-RNA用于敲减RUNX1，SMAD2，SMAD3基因；构建pCMV-Smad3，pCMV-Runx1过表达质粒，pRunx1-luc，pCol1a1-luc和pCol1a2-luc荧光素酶报告质粒用于评价RUNX1调控COL1的转录。<br>　　研究结果：<br>　　（1）TGF-β1可诱导RP-2细胞RUNX1表达增加和细胞核内聚集。（2）TGF-β1可诱导RP-2细胞早期合成RUNX1和延后合成COL1A1和COL1A2。(3)敲低/抑制SMAD3或者实现SMAD3过表达可分别下调或上调RUNX1，COL1A1和COL1A2的合成，提示TGF-β1/SMAD3通路介导RP-2细胞RUNX1和COL1合成。（4）Co-IP结果显示TGF-β1可增加RP-2细胞pSMAD3/RUNX1/CBFβ形成，敲低RUNX1mRNA和抑制CBFβ与RUNX1结合或实现RUNX1过表达分别可下调或上调COL1A1和COL1A2的合成，提示RUNX1作为共激活因子参与TGF-β1/SMAD3介导的COL1转录调控。(5)Cal不影响TGF-β1诱导的pSMAD3水平，但显著抑制TGF-β1诱导的RUNX1水平和pSMAD3/RUNX1/CBFβ复合物形成。<br>　　结论：<br>　　RUNX1是PSC内TGF-β1/SMAD3介导的早期应答产物，其作为共激活因子以pSMAD3/RUNX1/CBFβ形式参与TGF-β1诱导PSC内COL1mRNA的转录，Cal通过下调RUNX1抑制TGF-β1/SMAD3介导的COL1合成。本研究结果提示RUNX1有可能作为Cal治疗胰腺纤维化的一个潜在靶点。