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摘要研究目的：<br>　　探究Afamin蛋白对丙酸睾酮（TP）诱导的KGN细胞氧化应激相关功能的影响，并从线粒体功能、细胞凋亡和类固醇激素分泌功能方面探究Afamin蛋白对颗粒细胞的调节作用及其机制。<br>　　研究方法及结果：<br>　　1.Afamin蛋白对TP处理的KGN细胞氧化应激水平的影响<br>　　将实验分为Control组（空白对照组）、TP组和Afamin蛋白+TP组，借鉴本课题组前期实验研究的经验及参考相关文献最终选取浓度为50μM的TP及50ng/ml的Afamin蛋白作为实验浓度。KGN细胞中的ROS和超氧化物阴离子水平通过流式细胞术进行检测，并使用相应的试剂盒测量氧化应激的生物标志物丙二醛（MDA）水平。结果显示，TP组KGN细胞中ROS、超氧化物阴离子水平及MDA水平明显升高（P＜0.05)，添加Afamin蛋白组ROS、超氧化物阴离子水平及MDA水平明显下降（P＜0.05）。进一步通过相对应的抗氧化酶试剂盒进行一系列抗氧化酶活性的检测，如谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）以及超氧化物歧化酶（SOD）。结果表明，TP组SOD、CAT、GSH-Px以及GR的抗氧化酶活性下降（P＜0.05）；加入Afamin蛋白增加了上述抗氧化酶的活性（P＜0.05）。<br>　　2.Afamin蛋白对TP处理的KGN细胞线粒体功能和凋亡的影响<br>　　为了探究TP处理的KGN细胞出现氧化应激是否也引起了KGN细胞线粒体功能的损害及细胞凋亡的发生。KGN细胞经上述相同方式处理后，使用流式细胞术对KGN细胞线粒体膜电位（MMP）和线粒体O2-水平进行分析，发现与对照组相比，TP组MMP水平明显下降（P＜0.05），细胞内的线粒体O2-水平增加（P＜0.05）；加入Afamin蛋白后恢复了MMP及线粒体O2-的正常水平（P＜0.05）。此外，线粒体是ATP合成的重要细胞内细胞器，遂使用相应试剂盒测定ATP的水平，结果显示，TP组线粒体功能指标ATP水平下降（P＜0.05），而加入Afamin蛋白组ATP水平升高（P＜0.05）。<br>　　众所周知，氧化应激的存在及线粒体的损害会引起细胞的凋亡，遂使用流式细胞术进行细胞凋亡的检测，结果表明，TP组KGN细胞的凋亡情况明显增加，加入Afamin蛋白组的KGN细胞凋亡明显降低。进一步采用荧光定量PCR技术对KGN细胞凋亡相关基因进行了分析，结果表明，经TP处理后，促进细胞凋亡的基因BAX的表达明显增加（P＜0.05），抑制凋亡的基因BCL-2的表达明显下降（P＜0.05）；但加入Afamin蛋白后，BAX表达明显下调（P＜0.05），BCL-2的表达明显上调（P＜0.05）。在促进细胞凋亡的途径中，Caspase-3起着不可替代的作用，故使用相应的检测试剂盒测定Caspase-3活性，结果显示，TP组KGN细胞内Caspase-3活性增加（P＜0.05），而加入Afamin蛋白组Caspase-3活性明显下降（P＜0.05）。<br>　　3.Afamin蛋白对TP处理的KGN细胞类固醇激素合成的影响<br>　　研究显示，过度氧化应激会诱导颗粒细胞的病理变化，颗粒细胞是类固醇雌激素（E2）和孕激素（P）的主要来源，因此通过ELISA检测方法对KGN细胞培养上清液中的E2及P水平进行测定。结果表明，与对照组比较，TP组KGN细胞的分泌功能出现异常，表现为E2分泌水平的增加以及P分泌的减少（P＜0.05），而Afamin蛋白能够恢复KGN细胞中E2及P的异常分泌水平（P＜0.05）。进一步通过荧光定量PCR检测KGN细胞中类固醇激素合成相关基因STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP19A1表达量的变化情况。结果表明，TP组STAR、HSD3B1、CYP11A1的mRNA表达量下降、而CYP19A1mRNA表达量明显上升（P＜0.05），相反，在加入Afamin蛋白的KGN细胞中出现STAR、HSD3B1、CYP11A1mRNA表达量的升高以及CYP19A1mRNA表达量的降低（P＜0.05）。<br>　　研究结论：<br>　　1．Afamin蛋白通过降低氧化损伤的标志物水平，增强抗氧化酶的活性来减少TP引起的KGN细胞的氧化应激；<br>　　2．Afamin蛋白能够改善线粒体膜电位和ATP水平等修复线粒体功能紊乱并且通过降低Caspase-3的活性和上调抗凋亡基因（BCL-2）及下调促凋亡基因（BAX）的表达来对抗KGN细胞由TP引起的细胞凋亡；<br>　　3．Afamin蛋白通过影响卵巢类固醇激素合成相关基因的表达来改善TP诱导的KGN细胞出现的内分泌功能紊乱。